张锋最新《Cell》「DNA 显微镜」是怎么给细胞成像的，有哪些突破和意义？

2019年6月20日，作为CRISPR基因编辑的奠基人之一的张锋教授，在Cell杂志发表了一篇重磅论文，张锋及其合作者开发了一种全新的显微镜：DNA显微镜。
DNA显微镜，不依赖光或任何类型的光学器件，通过独特的成像模式，可将物理图像编码为DNA，并以精确的序列信息推断细胞解析度的原始转录物的物理图像，从而实现在基因组水平上对细胞的观察。
通过DNA显微镜，科学家们可以构建细胞图像并同时积累大量的基因组信息。为人们提供了另一层之前无法看到的生物学世界。
原文：DNA Microscopy: Optics-free Spatio-genetic Imaging by a Stand-Alone Chemical Reaction
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DNA分子显微镜这项技术原理和2009年开发出来的染色质构象捕获技术Chromatin Comformation capture（3C）差不多。它从看染色质结构角度衍伸到看全细胞结构，从DNA转变成RNA，从概念上有了新提升。

首先讲下3C技术原理，可以帮助更好地理解DNA显微镜。

细胞核内DNA分子如果全部展开，有2米多长。只有经过有规律地折叠，才能被装入微米级别的细胞核中。这些DNA折叠有松有紧，松的构成常染色质，转录活跃；紧的构成异染色质，转录减少。两类染色体动态变化和基因表达紧密相关，因此，染色质结构变化是研究基因转录调控的重要科学问题。为了了解染色质构象变化，2009年开发了3C技术。3C，染色质构象捕捉，就是把细胞核内的线团原地剪碎，拿序列1-特定序列-序列2作为引物进行一轮原位PCR扩增。如果两个DNA片段（片段1和片段2）在线团里位置很近，有很高概率被扩增到同一个PCR产物中。由此大规模给引物扩增，就能知道染色体中DNA谁和谁位置更近，得到整个染色体构象。

下面再讲讲这次的新技术DNA显微镜。

其实……它是个RNA显微镜。在细胞中有很多RNA，处于不同位置。之前用于探测RNA在细胞内分布的技术，叫作原位杂交。把细胞固定好，用和目标RNA结合的探针标记上去，利用探针上的荧光观察RNA在细胞内的位置。而这次DNA显微镜技术，和3C差不多。先将细胞固定，原位把RNA反转录成cDNA，加特定序列扩增，cDNA上就被加上标签。不同标签在扩增时，通过引物重叠区域，把距离近的两个cDNA扩增到一起，由此知道这两个cDNA空间距离很近。最终通过测序可以得到全部目标cDNA（即RNA）在细胞的分布。

由于新技术基于PCR扩增，PCR扩增效率受引物序列和模板浓度影响，实验起来比较tricky，技术还是需要很多优化。

总体来说是很棒的概念，卖点DNA microsope给得非常好。

谢邀~

在一定意义上，DNA显微镜和DNA存储技术类似——在传统领域引入新概念，从一个全新的维度开创了空间成像。

传统的显微成像技术，起源于17世纪发展起来的的光学显微镜。从光学显微镜，到现代的电镜或荧光显微镜，其本质都是用「看」的——由样品本身发射信号（质子或电子），而显微镜用来监测发射源。在生物学上，这类成像可以直接看到细胞内的各个细胞器的结构及其在生命过程中的活动。

另一类成像技术则是基于样品的断层扫描，例如医院常用的CT技术，工作的时候就是把人体分成很薄的一层层，逐一扫描，然后再借助电脑，将画面重构并整合到一起，成为一个完整的个体。

Weinstein, Regev和张锋希望同时得到多重结果——一来，看到细胞内的结构；二来，在此基础上得到相关的遗传序列信息。

基于这一想法，他们设计了几个DNA序列，代号为UMI （Unique molecular identifier），这是一种用DNA构成的标签。实验对象是生长中的细胞。可以想像，细胞中的各类分子每时每刻都在运动过程中；化学试剂可以令运动停止，细胞就像被冻结在某一刻。

实验的第一步是反转录（就是在体外从mRNA构建cDNA，从而研究基因表达情况）。在反转录过程中，UMI标签在细胞内可以自行找到互补的mRNA序列并与之结合。

标签的作用有两种：第一是作为识别信号，那么这类标签的序列应该是所有基因通用的，例如ATG启动子啊TCA终结子等等（当然，ATG、TCA只是例子，实际的标签比ATG这三个碱基复杂得多，有29个碱基）；第二是作为定向工具，用以寻找特定的序列（比如，科学家假设在A条件下，X基因的几种不同的剪接体splicing variant里，C表达而D不表达；那么他们就可以根据C序列来设计标签）。

总之，当反转录结束时，细胞内所有分子都带上了各种UMI标签。

第二步是UMI的体外扩增。通过重叠延伸PCR（overlap-extension PCR）技术，UMI的数目扩增，信号增强；用本文第一作者Weinstein接受HHMI采访时的原话：每个分子就好像是发射各自信号的广播台。

伴随UMI和DNA数目扩增，细胞内的空间逐渐减少，最终不同的分子就会碰到一起，不同UMI会相互反应，连接到一起，形成新的事件标签UEI（unique event identifier）。可以想像，原先距离相近的分子之间UMI碰撞的概率很大，形成的UEI也就很多。反之亦然。

第三步，也是最后一步，是通过DNA测序技术识别UEI信号。这一步骤目前长达30小时，因为每个细胞样本中都有5亿个DNA碱基有待测序。最终，根据获得的各类UEI信号数目和统计学计算，可以借助计算机解码，得到所有待测分子在细胞中的相对距离，还原细胞结构。

我只是看了个大概，还没有仔细阅读这篇paper。个人认为，这个技术在目前当然很不成熟，但是它非常有趣，前景广阔。举个简单的例子，很多癌症都是由基因突变引起的，当基因突变以后，分子构型会有什么变化？这个分子本身的变化，是不是会引起细胞内其他结构变化？以往的技术可以得到基因突变，可以得到分子构型变化，却无法同步（或者说，在同一个细胞内）监测两者。运用DNA显微镜技术，药物科学家就可以更好地设计针对基因突变的靶向药物。

当然，目前的缺陷也是显而易见的。整个技术依赖UMI。UMI要怎么设计，才可以覆盖大多数分子，又不会在进入的时候相互黏连？要怎样让不同的UMI进入细胞，随机与细胞内的分子结合？细胞内有些地方如果富含分子，结构非常挤，会不会对UMI的结合产生不利影响？PCR技术中，所有的产物是以2的指数次形成的；换言之，PCR能够探测的不同分子间的UEI的最小差别也必然是2的倍数；那么对这个技术的检测限是不是有影响？这个技术的假阳性率会有多少？等等。。

知乎上流传著一个古老的笑话，「二十一世纪是生物学的世纪。」

作为一个本科毕业后在生物研究中耗费了整整十年青春的研究者，我对这句话又爱又恨。每每写论文、改论文、甚至审论文的时候，都感叹：满纸荒唐言，一把辛酸泪。都云作者痴，谁解其中味？

可是，仔细想想，这句说的是事实。地球上最精密的机器无疑是生命体——它们的设计是如此精妙，以至于穷尽人类智慧，至今也只能初窥其一斑。无论是DNA存储，还是DNA显微镜，都是将生命科学中最基础的原理运用到现代工程上，即使方法不成熟，仍可预见其广阔的未来。

我拭目以待，在我的有生之年，会有多少生物「定律」会被推翻，多少医学常识被证伪。

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这篇论文主要有两个新颖的部分：其一是在细胞 in situ 进行带标记的 PCR，其二是从标记重叠的资料推算出图片的演算法。整个研究从头到尾是化学操作，不使用任何光学仪器。最终的图片是从资料计算而得到。

不过，从资料推算出的图片，以目前的技术，解析度还是相对低的。以下是这篇论文的 Figure 4: