張鋒最新《Cell》「DNA 顯微鏡」是怎麼給細胞成像的，有哪些突破和意義？

2019年6月20日，作為CRISPR基因編輯的奠基人之一的張鋒教授，在Cell雜誌發表了一篇重磅論文，張鋒及其合作者開發了一種全新的顯微鏡：DNA顯微鏡。
DNA顯微鏡，不依賴光或任何類型的光學器件，通過獨特的成像模式，可將物理圖像編碼為DNA，並以精確的序列信息推斷細胞解析度的原始轉錄物的物理圖像，從而實現在基因組水平上對細胞的觀察。
通過DNA顯微鏡，科學家們可以構建細胞圖像並同時積累大量的基因組信息。為人們提供了另一層之前無法看到的生物學世界。
原文：DNA Microscopy: Optics-free Spatio-genetic Imaging by a Stand-Alone Chemical Reaction
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DNA分子顯微鏡這項技術原理和2009年開發出來的染色質構象捕獲技術Chromatin Comformation capture（3C）差不多。它從看染色質結構角度衍伸到看全細胞結構，從DNA轉變成RNA，從概念上有了新提升。

首先講下3C技術原理，可以幫助更好地理解DNA顯微鏡。

細胞核內DNA分子如果全部展開，有2米多長。只有經過有規律地摺疊，才能被裝入微米級別的細胞核中。這些DNA摺疊有松有緊，松的構成常染色質，轉錄活躍；緊的構成異染色質，轉錄減少。兩類染色體動態變化和基因表達緊密相關，因此，染色質結構變化是研究基因轉錄調控的重要科學問題。為了了解染色質構象變化，2009年開發了3C技術。3C，染色質構象捕捉，就是把細胞核內的線團原地剪碎，拿序列1-特定序列-序列2作為引物進行一輪原位PCR擴增。如果兩個DNA片段（片段1和片段2）在線團裏位置很近，有很高概率被擴增到同一個PCR產物中。由此大規模給引物擴增，就能知道染色體中DNA誰和誰位置更近，得到整個染色體構象。

下面再講講這次的新技術DNA顯微鏡。

其實……它是個RNA顯微鏡。在細胞中有很多RNA，處於不同位置。之前用於探測RNA在細胞內分佈的技術，叫作原位雜交。把細胞固定好，用和目標RNA結合的探針標記上去，利用探針上的熒光觀察RNA在細胞內的位置。而這次DNA顯微鏡技術，和3C差不多。先將細胞固定，原位把RNA反轉錄成cDNA，加特定序列擴增，cDNA上就被加上標籤。不同標籤在擴增時，通過引物重疊區域，把距離近的兩個cDNA擴增到一起，由此知道這兩個cDNA空間距離很近。最終通過測序可以得到全部目標cDNA（即RNA）在細胞的分佈。

由於新技術基於PCR擴增，PCR擴增效率受引物序列和模板濃度影響，實驗起來比較tricky，技術還是需要很多優化。

總體來說是很棒的概念，賣點DNA microsope給得非常好。

謝邀~

在一定意義上，DNA顯微鏡和DNA存儲技術類似——在傳統領域引入新概念，從一個全新的維度開創了空間成像。

傳統的顯微成像技術，起源於17世紀發展起來的的光學顯微鏡。從光學顯微鏡，到現代的電鏡或熒光顯微鏡，其本質都是用「看」的——由樣品本身發射信號（質子或電子），而顯微鏡用來監測發射源。在生物學上，這類成像可以直接看到細胞內的各個細胞器的結構及其在生命過程中的活動。

另一類成像技術則是基於樣品的斷層掃描，例如醫院常用的CT技術，工作的時候就是把人體分成很薄的一層層，逐一掃描，然後再藉助電腦，將畫面重構並整合到一起，成為一個完整的個體。

Weinstein, Regev和張鋒希望同時得到多重結果——一來，看到細胞內的結構；二來，在此基礎上得到相關的遺傳序列信息。

基於這一想法，他們設計了幾個DNA序列，代號為UMI （Unique molecular identifier），這是一種用DNA構成的標籤。實驗對象是生長中的細胞。可以想像，細胞中的各類分子每時每刻都在運動過程中；化學試劑可以令運動停止，細胞就像被凍結在某一刻。

實驗的第一步是反轉錄（就是在體外從mRNA構建cDNA，從而研究基因表達情況）。在反轉錄過程中，UMI標籤在細胞內可以自行找到互補的mRNA序列並與之結合。

標籤的作用有兩種：第一是作為識別信號，那麼這類標籤的序列應該是所有基因通用的，例如ATG啟動子啊TCA終結子等等（當然，ATG、TCA只是例子，實際的標籤比ATG這三個鹼基複雜得多，有29個鹼基）；第二是作為定向工具，用以尋找特定的序列（比如，科學家假設在A條件下，X基因的幾種不同的剪接體splicing variant裏，C表達而D不表達；那麼他們就可以根據C序列來設計標籤）。

總之，當反轉錄結束時，細胞內所有分子都帶上了各種UMI標籤。

第二步是UMI的體外擴增。通過重疊延伸PCR（overlap-extension PCR）技術，UMI的數目擴增，信號增強；用本文第一作者Weinstein接受HHMI採訪時的原話：每個分子就好像是發射各自信號的廣播臺。

伴隨UMI和DNA數目擴增，細胞內的空間逐漸減少，最終不同的分子就會碰到一起，不同UMI會相互反應，連接到一起，形成新的事件標籤UEI（unique event identifier）。可以想像，原先距離相近的分子之間UMI碰撞的概率很大，形成的UEI也就很多。反之亦然。

第三步，也是最後一步，是通過DNA測序技術識別UEI信號。這一步驟目前長達30小時，因為每個細胞樣本中都有5億個DNA鹼基有待測序。最終，根據獲得的各類UEI信號數目和統計學計算，可以藉助計算機解碼，得到所有待測分子在細胞中的相對距離，還原細胞結構。

我只是看了個大概，還沒有仔細閱讀這篇paper。個人認為，這個技術在目前當然很不成熟，但是它非常有趣，前景廣闊。舉個簡單的例子，很多癌症都是由基因突變引起的，當基因突變以後，分子構型會有什麼變化？這個分子本身的變化，是不是會引起細胞內其他結構變化？以往的技術可以得到基因突變，可以得到分子構型變化，卻無法同步（或者說，在同一個細胞內）監測兩者。運用DNA顯微鏡技術，藥物科學家就可以更好地設計針對基因突變的靶向藥物。

當然，目前的缺陷也是顯而易見的。整個技術依賴UMI。UMI要怎麼設計，纔可以覆蓋大多數分子，又不會在進入的時候相互黏連？要怎樣讓不同的UMI進入細胞，隨機與細胞內的分子結合？細胞內有些地方如果富含分子，結構非常擠，會不會對UMI的結合產生不利影響？PCR技術中，所有的產物是以2的指數次形成的；換言之，PCR能夠探測的不同分子間的UEI的最小差別也必然是2的倍數；那麼對這個技術的檢測限是不是有影響？這個技術的假陽性率會有多少？等等。。

知乎上流傳著一個古老的笑話，「二十一世紀是生物學的世紀。」

作為一個本科畢業後在生物研究中耗費了整整十年青春的研究者，我對這句話又愛又恨。每每寫論文、改論文、甚至審論文的時候，都感嘆：滿紙荒唐言，一把辛酸淚。都雲作者癡，誰解其中味？

可是，仔細想想，這句說的是事實。地球上最精密的機器無疑是生命體——它們的設計是如此精妙，以至於窮盡人類智慧，至今也只能初窺其一斑。無論是DNA存儲，還是DNA顯微鏡，都是將生命科學中最基礎的原理運用到現代工程上，即使方法不成熟，仍可預見其廣闊的未來。

我拭目以待，在我的有生之年，會有多少生物「定律」會被推翻，多少醫學常識被證偽。

最後，歡迎大家關注我的公眾號：閑來偶寄，專註於健康相關的原創科普寫作。

這篇論文主要有兩個新穎的部分：其一是在細胞 in situ 進行帶標記的 PCR，其二是從標記重疊的資料推算出圖片的演算法。整個研究從頭到尾是化學操作，不使用任何光學儀器。最終的圖片是從資料計算而得到。

不過，從資料推算出的圖片，以目前的技術，解析度還是相對低的。以下是這篇論文的 Figure 4: