如何解读《Cell》合成生物学新成果，改造出只消耗二氧化碳就能自养生长的大肠杆菌？
2019年11月27日，《Cell》杂志在线发表了来自以色列魏茨曼科学研究所Ron Milo课题组题为「Conversion of Escherichia coli to Generate All Biomass Carbon from CO2」的研究论文。该研究利用合成生物学构建了一种全新的大肠杆菌菌株，这种菌株是以消耗二氧化碳作为碳源，而不是常规的有机物质，实现了自养生长。
Conversion of Escherichia coli to Generate All Biomass Carbon from CO2: Cell?www.cell.com
在生命进化的历史长河中，从第一个生命诞生开始到第一个可以利用二氧化碳的自养型生命出现一共经历了多久的时间？答案：20亿年[1]；
而合成生物学家利用工程改造和实验室进化将一个细菌改造成可以利用二氧化碳的自养型细菌需要多久？答案：仅需要200天；
这个世界的生物大致上可以分为两种：第一种是将二氧化碳转化为生物质的自养型生物，第二种是无法自己生产有机物从而消耗有机物的异养型生物。
自养型生物在生态中的重要价值不言而喻，其以二氧化碳等无机物为来源自行制造有机物供自身生长需要，包括全部绿色植物和化学合成细菌，它们是生态系统中有机物的生产者，是生态系统中食物链的基础。
正由于其重要性，科学界一直想要为了更好的理解自养型生物生长的基本机制和原则，以及如何增强这个过程，比如我们可以使植物的光合作用速率更加高效。
在这一方面，一个很富有挑战性的研究方向便是利用合成生物学将一个异养型生物改造成一个自养型生物。通过这个过程，我们可以「建物致知」，进一步了解自然自养型生物的限制，以及如何提高相关的代谢通路的效率。
为了使一个异养型生物变成一个自养型生物需要做什么？大致需要做到以下三点：
1. 细胞内具有二氧化碳的固定机制，使细胞的碳摄入只依赖于二氧化碳，同时可以产生必要的有机化学物质
2. 细胞具有相应的酶反应机制获取生命必需的还原力，比如利用非化学能源（光、电等）或者氧化不用作碳源的还原化合物
3. 细胞能够调控和协调能量获取和二氧化碳固定途径，以便可以在以二氧化碳为唯一碳源时，细胞可以实现稳态生长
其实在这方面很早就有科学家在尝试，但是结果均无法实现对于二氧化碳的专一依赖，只能在提供二氧化碳的同时提供其他的营养物质才能维持细胞的正常生长。所以在这方面仍然是一个很大的挑战。
2019年11月28日，来自以色列的科研工作者与其合作者们在这一领域取得重大突破，其文章Conversion of Escherichia colito Generate All Biomass Carbon from CO2报道了他们首次通过合成生物学改造和实验室进化构建出仅利用CO2作为唯一碳源的自养型大肠杆菌的研究成果[2]。
如何将一个异养型大肠杆菌改造成自养型大肠杆菌？
第一步：对代谢通路的重新设计——引入异源的自养代谢途径
为了在实验室中将大肠杆菌转化为自养菌，研究人员考虑了几种候选化合物作为二氧化碳固定的电子供体。最终其选择甲酸盐作为电子供体，因为这种一碳有机化合物可以用作还原力的来源（需要额外在细菌内引入NAD+偶联的甲酸脱氢酶），但不能被大肠杆菌利用，从而无法转化成为生物质。同时这种物质可以通过电化学的方式利用可再生能源进行生产。
同时研究人员还在细菌内引入了FDH（甲酸脱氢酶），Rubisco （二磷酸核酮糖羧化酶）以及PrK（磷酸核酮糖激酶）。理论分析引入这三种酶是可以实现大肠杆菌的自养生长的，但是研究人员的研究结果是失败的。
其中可能失败的原因在于中心代谢途径与自养代谢途径之间的竞争。非天然酶机制的异源表达扩大了细胞可能发生的代谢反应的空间，理论上可以实现自养生长。 实际上，由于大肠杆菌的中心代谢途是适应于异养生长的，所以即使有存在自养代谢途径，细胞也很可能无法利用。
此时尝试通过理性设计似乎不太可能了，因为要修改中心代谢途径代表著需要对细胞代谢途径的重塑，这是极其困难的，同时我们甚至都不知道如何重塑。即使对于大肠杆菌，我们对于其复杂网路的理解也是受限的。所以作者尝试了实验室适应进化（adaptive laboratory evolution）的方法来获得完全以二氧化碳为碳源的自养大肠杆菌。
第二步：实验室适应性进化（Adaptive Laboratory Evolution）
首先研究人员敲除了碳源代谢途径中的两个关键酶—磷酸果糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，这样一来，在培养在木糖的环境中时，二氧化碳的脱羧过程只依赖于Rubisco。同时研究人员在细菌内过表达之前提到的FDH（甲酸脱氢酶），Rubisco （二磷酸核酮糖羧化酶）以及PrK（磷酸核酮糖激酶）。
作者将改造后的大肠杆菌培养在木糖限制的恒化器中，使其慢慢进化。这个其实就类似于「温水煮青蛙」的过程。作者的目的是进化出一株以二氧化碳为碳源的自养大肠杆菌。其原始菌株是没有这个功能的，需要提供木糖才能生存。所以在进化的一开始，作者就在培养环境中加上了木糖，同时加上二氧化碳。在接下来的进化过程中逐步的减少木糖的存在，这样一来，能够更少利用木糖，更倾向于利用二氧化碳的个体就会逐渐在培养环境中富集起来。最后木糖的含量会最终减为0，环境中只存在于二氧化碳，而这些培养环境中的细菌就剩下利用二氧化塘的个体，而只能利用木糖的个体全部被淘汰了。
第三步：对进化过程进行监测
- 每隔一段时间，作者就从恒化器中取出细菌在不含木糖的培养基中培养，观察其是否存在生长的现象。
- 在整整进化了200天之后，作者终于观察到了这些细菌能够在不含木糖的培养基中生长起来，在之后从恒化器中取出的细菌都可以生长了。
- 在350天的时候，作者将恒化器中的木糖全部去除了。作者在之后实验中发现，这里面的细菌都可以脱离对于木糖的依赖，同时在提高二氧化碳浓度后，这些细菌可以长的更好。
- 在经过大约400天的时候之后，作者最终从恒化器中分离出了一些菌株，并对其进行了相应的分析，作者发现这些菌株的确能够只在二氧化碳的环境中存在。但是发现其繁殖速率超慢，正常的大肠杆菌是20min-1h繁殖一代，而这个细菌是18个小时才繁殖一代。
后来作者又通过碳13标记技术，对于整个代谢通路碳源的走向进行了测定，结果发现进化后的大肠杆菌的确是只将CO2作为唯一碳源的，而甲酸盐中的碳不直接参与代谢过程，最终以CO2的形式排放出去（当然这些最终氧化产生的CO2也可能会被重新利用，但归根到底，这个细胞还是利用CO2的）
自养型大肠杆菌内部到底进化了什么，使其发生了这么大的改变？
进化的过程会产生很多突变，而分析这些突变即是分析自养型大肠杆菌如何产生的关键。但是令人吃惊的，通过基因组测序，研究人员发现自养型大肠杆菌相比于原始的非自养菌株的基因突变是相对很少的，这些突变大致可以分为三类：
第一类：直接和异源和内源碳代谢途径相关的突变
这一类突变主要是平衡碳代谢途径中的流量（Flux）分配，以确保稳定的细胞生长和生物量生产。
第二类：实验室进化实验中常见的的突变基因
这些突变一般是由于环境选择压力下选择的突变，在长期进化实验中很常见。有的是具有全局调控功能的突变类型，其可能对于重塑整个代谢通路上具有一定的作用。
第三类：未知功能的突变
这些突变目前还未知其具体的进化功能。有的则可能是常见的「搭车突变」，这些突变无关紧要，但是由于和其他的一些重要突变可能位于相近的区域而最终被保留下来，这类现象在长期进化实验中也很常见。
总结
一句话总结这篇文章就是：研究人员以异养型大肠杆菌为对象，最终利用实验室进化，创造了一个以二氧化碳为唯一碳源的自养型大肠杆菌。
以下是我个人的思考：
- 现在的这个细菌真的可以用于去吸收环境中的二氧化碳，减少全球气候变暖吗？
答案显然是否定的，目前的这个自养型大肠杆菌还无法实现在生长和能量获取上的平衡。
首先，此细菌的繁殖速度是极慢的，相比如正常大肠杆菌的20min-1h/代，此细菌只能18个小时复制一代，繁殖速度的缓慢极大的限制其潜在的应用价值。
同时，这个细菌虽然会利用二氧化碳，但是固定时间下，二氧化碳实际是增加了。此细菌利用的CO2的速率小于甲酸盐被氧化成二氧化碳的速率，所以二氧化碳的净生成速率是正值。
所以为了减少环境中的二氧化碳，未来可能需要偶联一个可再生能源途径去将二氧化碳再合成甲酸钠进行利用，或者找到其他化合物替代甲酸钠为体系供能。
2. 这篇文章的分析过程，特别是对于最终自养型大肠杆菌的代谢分析是很简单的，并没有进行深入的分析
作者在文章背景部分提到「建物致知」，但是实际上，作者分析的结果对我们以后进行理性设计类似的生物并没有明确的指导意义。
作者只分析了相关的突变类型，以及潜在的关联，但是并没有进行深入的组学分析。同时作者在400天的进化过程中，也没有分析进化过程中的基因组突变变化，其实是浪费了一个重要的数据分析过程。如果我们能对进化过程中每隔一段时间就进行一次基因组的序列分析，基本可以还原整个进化的过程，这有助于了解整个进化的过程，内部代谢网路是如何变化的。这可以提供更多值得学习的价值，同时提供更多未来理性设计的思路。（当然这个需要大量的科研经费，很烧钱）
今年在Nature Communication上发表了一篇也是实验室进化（进化了60多天，使一个慢速生长细菌的生长速度变得越来越快）的文章[3]，其中就对进化过程以及组学数据进行了详细的分析，我曾经在组会上对其进行了解读。所以我认为这篇Cell文章在后续的工作可以进行更加详细的分析，挖掘更加丰富的信息。
3. 进化的结果看似炫酷，但是长时间的等待是枯燥和令人痛苦的
- 400天的进化，在200天才看到明显的结果，这样的过程我想一定很煎熬的
- 我在实验室中也做过很多进化，虽然和本文章的试验方法不同，但是我进化的时间往往只有几十个小时，最多所有时间加起来只有2周的时间。有的时间我会得到很多进化出来的突变体，但是有的时间得不到，进而就放弃了。
- 但是作者进行进化了超过1年的时间，这的确让人佩服。这个过程需要非常详细的实验设计以确保长时间的实验能够完整流畅的进行，同时也需要超乎常人的毅力和决心：相信进化这个生物最强大的功能可以带来想要的未来。
4. 这篇文章也让我想到前段时间读过的一篇Nature子刊文章[4]——细胞霸权：相比于计算机，生命最强大的地方在于哪里？
https://www.nature.com/articles/s41467-019-13232-z?www.nature.com我们都知道量子霸权，即量子计算机实现霸权后可以在极短的时间内解决传统计算机需要近万年时间才能解决的问题。
细胞霸权也是如此。合成生物学一直将生命比作一种高级的机器，一种高级的计算机。通过这种比喻，合成生物学也在电路系统、工程的各种理念引入到细胞之中，比如过于强调理性设计，构建各种逻辑基因电路、可预测、正交化等等思路。但是这种思路在经过20年的发展之后，取得了一定的成功，但是也面临著更多的瓶颈。
这种思路在一定程度也限制合成生物学对于生命的理解，总会有人问一句：这件事情上传统计算机能够做，为什么还要在细胞中做一遍吗（比如逻辑运算）？诚然，这当然是非常有用的，通过让细胞进行逻辑运算可以使其作为工程机器治疗复杂的癌症，在人体内检测不同的身体状态。
但是如何才能发挥生命的最大用处，相比如传统计算机，细胞或者生命的「霸权」在哪里？也就是其特殊性以及优越性在哪里？
在这篇关于「细胞霸权」的文章中，其中作者提到了细胞在计算上的霸权所在之处：
- Reconfigurability 可重构性: 细胞能够根据外界信号改变自身的内部结构（这一点经典的计算机在运行演算法上是固定的，无法改变）
- Noise 杂讯: 不仅能够容忍而且能够利用生物学上「混乱」的能力（传统计算机强调运行环境要清楚明确）
- Cocurrency 并发: 促进大规模并行通信和协调的细胞间过程的多样性和丰富性
- Representation 表示: 对信号使用非二进位表示的能力
- Evolution 进化: 随著时间的推移，在群体层面寻求新颖解决方案的能力
这篇发表在Cell的文章正好直接突出了以上的第五条和第一条。作者利用进化使细胞获得了全新的功能，同时在进化的过程中细胞重塑内部的关联：重塑了碳代谢相关的关键途径。
我想虽然这项工作目前的实际价值并不会很快显示出来，但是其给与我很大的震撼。进化的可塑性是远超人们想像的。
合成生物学在未来的研究中似乎还可以更加大胆一些！
参考
- ^https://en.wikipedia.org/wiki/Autotroph
- ^https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867419312309?via%3Dihub
- ^https://www.nature.com/articles/s41467-019-08888-6
- ^https://www.nature.com/articles/s41467-019-13232-z
谢 @schweine咸 邀请。
先谈谈总结：
Ron Milo教授研究团队以大肠杆菌为研究对象，以卡尔文循环为代谢基础，以适应性进化为优化工具最终实现了大肠杆菌从异养代谢向自养代谢的转化，打破了不同生物类型之间的「次元壁」。这一工作的意义还在于为我们今后直接利用大气中的CO2来合成食物，燃料以及其他生物分子提供了可能性，尤其对于温室效应越来越严重的今天而言，这项研究让人兴奋。
然而，Ron Milo教授也提出这项工作目前的不足之处，由于体系中的自养型大肠杆菌需要将甲酸钠氧化成CO2来供能，且产生CO2速率要高于其吸收的速率，所以实际上系统中CO2是净增加的，因此未来可能需要偶联一个可再生能源途径去将CO2再合成甲酸钠或者寻找其他化合物替代fomrate为体系供能。
以下为对该研究的具体解读。
自接触生物科学以来，我们就被告知自然界的生物可以分为三类：以植物为主的「生产者」，以动物为主的「消费者」和以微生物为主的「消费者」。随著对生物科学的深入了解，我们知道这些生物其实可以简单的分为两类：可以将CO2转化为有机物的自养生物(autotrophs)和以分解有机物为生的异养生物(heterotrophs)。因此，界定这两种生物唯一的标准就是判断其是否是利用CO2作为单一碳源。很长一段时间以来，科学家们一直努力尝试在实验室条件下将已知的异养生物转变成自养生物【1,2】，因为这不仅能帮助我们更好的理解自养生物的生存法则，此外，在构建自养生物的过程中，我们可以认识到自然界中的自养生物在自养代谢过程中的限制因素是什么，并以此来寻求方法去促进这一过程并实现无机碳源向有机物转换的可持续性。
自然界目前已知的有五种固碳途径：
卡尔文循环（Calvin-Benson-Bassham cycle ，CBB）、
还原性三羧酸循环(rTCA)、
还原性乙醯辅酶A途径（W-L循环）、
3-羟基丙酸/4-羟基丁酸（3HP/4HB）、
3-羟基丙酸、二羧酸/4-羟基丁酸（DC/4HB）。
其中最普遍的CO2固定途径是卡尔文循环，它广泛的存在于绿色植物体、蓝细菌、藻类、紫色细菌和一些变形菌中【3】。尽管科学家们已经在大肠杆菌中以卡尔文循环为代谢基础取得了巨大的进步，但遗憾的是一直没能取得最后的成功。
2019年11月28日，来自以色列威茨曼科学研究所的Ron Milo教授与其合作者们在这一领域取得重大突破，在Cell杂志上发表了题为Conversion of Escherichia coli to Generate All Biomass Carbon from CO2的研究，报道了他们首次在实验室内构建出只利用CO2作为唯一碳源的自养型大肠杆菌的研究成果。
为了构建出自养型大肠杆菌，作者将这一艰巨的任务拆分成三个部分：
第一，CO2只能作为唯一的碳源,并参与核心代谢用于合成12种生物大分子前体；
第二，在在大肠杆菌内过表达一套酶系统，该系统可以通过非化学能量诸如光、电等或者通过氧化非碳源的还原性化学物来获取还原力(reducing power，指生物氧化还原反应中产生的作为还原剂的高能化合物，如NADH、NADPH等)；
第三，必须要协调好CO2固定和能量获取这两个过程从而使得大肠杆菌能够稳定利用CO2作为唯一碳源生长。
这里值得一提的是，已有研究中，包括作者之前的研究，已经能够利用CO2作为碳源来维持大肠杆菌的生长，但可惜的是这一过程需要添加额外的碳源【1】。
为了解决这一难题，作者首先选用甲酸钠作为电子供体用于固定CO2,因为甲酸钠不仅可以提供还原力，并且在自然条件下不会被大肠杆菌作为碳源利用。为了将甲酸钠中的还原力释放出来，作者需要在大肠杆菌中过表达一套酶系统，包括甲酸脱氢酶(FDH), 二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)以及磷酸核酮糖激酶（phosphoribulo-kinase）。然而，在大肠杆菌中过表达了这三种重组酶并不能使得其在自养条件下进行生长。
于是作者决定利用实验室适应进化（adaptive laboratory evolution）的方法作为优化工具去获得完全自养的大肠杆菌。作者认为，实验失败的根本原因在于大肠杆菌本身是异养生物，所以其代谢流分配主要还是适应异养生长。
因此，作者首先通过敲除碳源代谢两个关键酶—磷酸果糖激酶（phosphofructokinase）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate-dehydrogenase）对大肠杆菌进行代谢重编程并使得其在以木糖为碳源的条件下依赖二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)的脱羧作用。紧接著，在此基础上再去过表达甲酸脱氢酶(FDH), 二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)以及磷酸核酮糖激酶（phosphoribulo-kinase）。最后，作者将改造后的大肠杆菌培养在木糖限制的恒化器中，使得大肠杆菌在能够维持生长的同时始终处于碳源饥饿的状态，从而保持一定的选择压力促进进化过程的发生。见下图。
经过约350天的实验室适应进化实验，作者完全撤掉了体系中的木糖并持续检测大肠杆菌的生长情况，结果表明大肠杆菌依旧可以正常生长。此外，作者利用C13标记的同位素实验证明，这些大肠杆菌只利用CO2作为唯一的碳源，这说明作者构建出了完全自养型大肠杆菌。
为了更好的阐述大肠杆菌在异养到自养转变过程的遗传基础，作者对这一过程不同时段的大肠杆菌菌株的基因组和质粒进行测序。作者将检测到的基因突变分成三个大类，第一类突变基因与卡尔文循环直接相关，总的来说，自养型大肠杆菌包含不止一个代谢分流点（flux branch point）的突变。第二类突变基因与之前实验室适应进化实验观测到的突变一致。第三类突变基因是一些当前未知功能的突变，因此需要后续的实验来证明其对大肠杆菌自养转变过程是否是必需的。
综上，Ron Milo教授研究团队以大肠杆菌为研究对象，以卡尔文循环为代谢基础，以适应性进化为优化工具最终实现了大肠杆菌从异养代谢向自养代谢的转化，打破了不同生物类型之间的「次元壁」。这一工作的意义还在于为我们今后直接利用大气中的CO2来合成食物，燃料以及其他生物分子提供了可能性，尤其对于温室效应越来越严重的今天而言，这项研究让人兴奋。
然而，Ron Milo教授也提出这项工作目前的不足之处，由于体系中的自养型大肠杆菌需要将甲酸钠氧化成CO2来供能，且产生CO2速率要高于其吸收的速率，所以实际上系统中CO2是净增加的，因此未来可能需要偶联一个可再生能源途径去将CO2再合成甲酸钠或者寻找其他化合物替代fomrate为体系供能。
标题"Conversion of Escherichia coli to Generate All Biomass Carbon from CO2" 强调的是使用二氧化碳作为所有的合成产物的碳源, 看图3B的同位素标记实验, 甲酸盐代谢出来的二氧化碳不会进入再循环, 考虑到大肠杆菌不一定有植物细胞里面那么多细胞器结构隔离各种反应, 还是挺有意思的.
个人觉得只是秀一下合成生物学的本事, 应用价值一般般, 尤其是考虑到甲酸盐消耗以后其实是生成二氧化碳的.
固定二氧化碳算是光合作用里面的暗反应, 还原剂 (NADH等等) 还需要通过人工添加还原剂 (甲酸盐) 来实现, 而氧化甲酸盐又会生成二氧化碳. 什么时候能搞定光反应直接才是NB, 但是蓝藻绿藻植物那么多物种能搞掂光反应, 你们折腾大肠杆菌干什么? // 等哪天他们真的弄出来个能光合作用的大肠杆菌我要审计他们的数据确认他们没有把叶绿体装进大肠杆菌
某双非一本生物工程学在读博士强答一发~
主要是释放下个人的想法，为了避免一些不必要的争执，就匿名了。
我个人觉得这个工作还是非常了不起的！是个很棒的工作。
读完这篇文章以后我个人有了一些想法：
首先，生物除了碳源之外，还是需要还原力的，原本的葡萄糖自身就具备还原力，然而二氧化碳难以用于还原生物小分子，毕竟二氧化碳里的电子基本都在氧手里，氧对电子的吸附能力太强，对生物体来说，氧的电子用于还原太难，作者考虑到了这一点，于是补充了甲酸来提供还原力。
其次，生物真的是越来越像机器了，具备了功能模块，就能执行相应功能，这项研究，佐证了这一点，我觉得非常了不起~
最后，我个人一直觉得，有一个问题如果不解决，我们这些生命科学研究者就很难真正的全面的掌控生命。那个问题就是细胞是如何做到基于基因的时序性表达继而控制自身的增殖的。细胞感知环境机理很多得到了解释，但是细胞自身是如何意识到自己该增殖了，并且通过代谢调控完成增殖，这始终是个困扰我的问题。我甚至觉得，生物化学这本书上，其实还有一个很重要的章节，至今没人能写，那个章节，就是基因的时序性调控（关于基因的时序性调控不是没有相关的研究，只是据我所知，目前关于生物钟研究主要还是集中在生物的行为节律上，而非细胞自身的增殖节律，所以关于细胞的增值节律，我个人一直在期待出现相关的研究）。
感谢那些了不起的以色列科学家的工作，真是非常漂亮的工作！
合成粮食人造肉，以后去火星就吃这个了。在地球也可以用来做饲料，煤变猪。
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