如何解讀《Cell》合成生物學新成果，改造出只消耗二氧化碳就能自養生長的大腸桿菌？
2019年11月27日，《Cell》雜誌在線發表了來自以色列魏茨曼科學研究所Ron Milo課題組題為「Conversion of Escherichia coli to Generate All Biomass Carbon from CO2」的研究論文。該研究利用合成生物學構建了一種全新的大腸桿菌菌株，這種菌株是以消耗二氧化碳作為碳源，而不是常規的有機物質，實現了自養生長。
Conversion of Escherichia coli to Generate All Biomass Carbon from CO2: Cell?www.cell.com
在生命進化的歷史長河中，從第一個生命誕生開始到第一個可以利用二氧化碳的自養型生命出現一共經歷了多久的時間？答案：20億年[1]；
而合成生物學家利用工程改造和實驗室進化將一個細菌改造成可以利用二氧化碳的自養型細菌需要多久？答案：僅需要200天；
這個世界的生物大致上可以分為兩種：第一種是將二氧化碳轉化為生物質的自養型生物，第二種是無法自己生產有機物從而消耗有機物的異養型生物。
自養型生物在生態中的重要價值不言而喻，其以二氧化碳等無機物為來源自行製造有機物供自身生長需要，包括全部綠色植物和化學合成細菌，它們是生態系統中有機物的生產者，是生態系統中食物鏈的基礎。
正由於其重要性，科學界一直想要為了更好的理解自養型生物生長的基本機制和原則，以及如何增強這個過程，比如我們可以使植物的光合作用速率更加高效。
在這一方面，一個很富有挑戰性的研究方向便是利用合成生物學將一個異養型生物改造成一個自養型生物。通過這個過程，我們可以「建物致知」，進一步瞭解自然自養型生物的限制，以及如何提高相關的代謝通路的效率。
為了使一個異養型生物變成一個自養型生物需要做什麼？大致需要做到以下三點：
1. 細胞內具有二氧化碳的固定機制，使細胞的碳攝入只依賴於二氧化碳，同時可以產生必要的有機化學物質
2. 細胞具有相應的酶反應機制獲取生命必需的還原力，比如利用非化學能源（光、電等）或者氧化不用作碳源的還原化合物
3. 細胞能夠調控和協調能量獲取和二氧化碳固定途徑，以便可以在以二氧化碳為唯一碳源時，細胞可以實現穩態生長
其實在這方面很早就有科學家在嘗試，但是結果均無法實現對於二氧化碳的專一依賴，只能在提供二氧化碳的同時提供其他的營養物質才能維持細胞的正常生長。所以在這方面仍然是一個很大的挑戰。
2019年11月28日，來自以色列的科研工作者與其合作者們在這一領域取得重大突破，其文章Conversion of Escherichia colito Generate All Biomass Carbon from CO2報道了他們首次通過合成生物學改造和實驗室進化構建出僅利用CO2作為唯一碳源的自養型大腸桿菌的研究成果[2]。
如何將一個異養型大腸桿菌改造成自養型大腸桿菌？
第一步：對代謝通路的重新設計——引入異源的自養代謝途徑
為了在實驗室中將大腸桿菌轉化為自養菌，研究人員考慮了幾種候選化合物作為二氧化碳固定的電子供體。最終其選擇甲酸鹽作為電子供體，因為這種一碳有機化合物可以用作還原力的來源（需要額外在細菌內引入NAD+偶聯的甲酸脫氫酶），但不能被大腸桿菌利用，從而無法轉化成為生物質。同時這種物質可以通過電化學的方式利用可再生能源進行生產。
同時研究人員還在細菌內引入了FDH（甲酸脫氫酶），Rubisco （二磷酸核酮糖羧化酶）以及PrK（磷酸核酮糖激酶）。理論分析引入這三種酶是可以實現大腸桿菌的自養生長的，但是研究人員的研究結果是失敗的。
其中可能失敗的原因在於中心代謝途徑與自養代謝途徑之間的競爭。非天然酶機制的異源表達擴大了細胞可能發生的代謝反應的空間，理論上可以實現自養生長。 實際上，由於大腸桿菌的中心代謝途是適應於異養生長的，所以即使有存在自養代謝途徑，細胞也很可能無法利用。
此時嘗試通過理性設計似乎不太可能了，因為要修改中心代謝途徑代表著需要對細胞代謝途徑的重塑，這是極其困難的，同時我們甚至都不知道如何重塑。即使對於大腸桿菌，我們對於其複雜網路的理解也是受限的。所以作者嘗試了實驗室適應進化（adaptive laboratory evolution）的方法來獲得完全以二氧化碳為碳源的自養大腸桿菌。
第二步：實驗室適應性進化（Adaptive Laboratory Evolution）
首先研究人員敲除了碳源代謝途徑中的兩個關鍵酶—磷酸果糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，這樣一來，在培養在木糖的環境中時，二氧化碳的脫羧過程只依賴於Rubisco。同時研究人員在細菌內過表達之前提到的FDH（甲酸脫氫酶），Rubisco （二磷酸核酮糖羧化酶）以及PrK（磷酸核酮糖激酶）。
作者將改造後的大腸桿菌培養在木糖限制的恆化器中，使其慢慢進化。這個其實就類似於「溫水煮青蛙」的過程。作者的目的是進化出一株以二氧化碳為碳源的自養大腸桿菌。其原始菌株是沒有這個功能的，需要提供木糖才能生存。所以在進化的一開始，作者就在培養環境中加上了木糖，同時加上二氧化碳。在接下來的進化過程中逐步的減少木糖的存在，這樣一來，能夠更少利用木糖，更傾向於利用二氧化碳的個體就會逐漸在培養環境中富集起來。最後木糖的含量會最終減為0，環境中只存在於二氧化碳，而這些培養環境中的細菌就剩下利用二氧化塘的個體，而只能利用木糖的個體全部被淘汰了。
第三步：對進化過程進行監測
- 每隔一段時間，作者就從恆化器中取出細菌在不含木糖的培養基中培養，觀察其是否存在生長的現象。
- 在整整進化了200天之後，作者終於觀察到了這些細菌能夠在不含木糖的培養基中生長起來，在之後從恆化器中取出的細菌都可以生長了。
- 在350天的時候，作者將恆化器中的木糖全部去除了。作者在之後實驗中發現，這裡面的細菌都可以脫離對於木糖的依賴，同時在提高二氧化碳濃度後，這些細菌可以長的更好。
- 在經過大約400天的時候之後，作者最終從恆化器中分離出了一些菌株，並對其進行了相應的分析，作者發現這些菌株的確能夠只在二氧化碳的環境中存在。但是發現其繁殖速率超慢，正常的大腸桿菌是20min-1h繁殖一代，而這個細菌是18個小時才繁殖一代。
後來作者又通過碳13標記技術，對於整個代謝通路碳源的走向進行了測定，結果發現進化後的大腸桿菌的確是隻將CO2作為唯一碳源的，而甲酸鹽中的碳不直接參與代謝過程，最終以CO2的形式排放出去（當然這些最終氧化產生的CO2也可能會被重新利用，但歸根到底，這個細胞還是利用CO2的）
自養型大腸桿菌內部到底進化了什麼，使其發生了這麼大的改變？
進化的過程會產生很多突變，而分析這些突變即是分析自養型大腸桿菌如何產生的關鍵。但是令人喫驚的，通過基因組測序，研究人員發現自養型大腸桿菌相比於原始的非自養菌株的基因突變是相對很少的，這些突變大致可以分為三類：
第一類：直接和異源和內源碳代謝途徑相關的突變
這一類突變主要是平衡碳代謝途徑中的流量（Flux）分配，以確保穩定的細胞生長和生物量生產。
第二類：實驗室進化實驗中常見的的突變基因
這些突變一般是由於環境選擇壓力下選擇的突變，在長期進化實驗中很常見。有的是具有全局調控功能的突變類型，其可能對於重塑整個代謝通路上具有一定的作用。
第三類：未知功能的突變
這些突變目前還未知其具體的進化功能。有的則可能是常見的「搭車突變」，這些突變無關緊要，但是由於和其他的一些重要突變可能位於相近的區域而最終被保留下來，這類現象在長期進化實驗中也很常見。
總結
一句話總結這篇文章就是：研究人員以異養型大腸桿菌為對象，最終利用實驗室進化，創造了一個以二氧化碳為唯一碳源的自養型大腸桿菌。
以下是我個人的思考：
- 現在的這個細菌真的可以用於去吸收環境中的二氧化碳，減少全球氣候變暖嗎？
答案顯然是否定的，目前的這個自養型大腸桿菌還無法實現在生長和能量獲取上的平衡。
首先，此細菌的繁殖速度是極慢的，相比如正常大腸桿菌的20min-1h/代，此細菌只能18個小時複製一代，繁殖速度的緩慢極大的限制其潛在的應用價值。
同時，這個細菌雖然會利用二氧化碳，但是固定時間下，二氧化碳實際是增加了。此細菌利用的CO2的速率小於甲酸鹽被氧化成二氧化碳的速率，所以二氧化碳的凈生成速率是正值。
所以為了減少環境中的二氧化碳，未來可能需要偶聯一個可再生能源途徑去將二氧化碳再合成甲酸鈉進行利用，或者找到其他化合物替代甲酸鈉為體系供能。
2. 這篇文章的分析過程，特別是對於最終自養型大腸桿菌的代謝分析是很簡單的，並沒有進行深入的分析
作者在文章背景部分提到「建物致知」，但是實際上，作者分析的結果對我們以後進行理性設計類似的生物並沒有明確的指導意義。
作者只分析了相關的突變類型，以及潛在的關聯，但是並沒有進行深入的組學分析。同時作者在400天的進化過程中，也沒有分析進化過程中的基因組突變變化，其實是浪費了一個重要的數據分析過程。如果我們能對進化過程中每隔一段時間就進行一次基因組的序列分析，基本可以還原整個進化的過程，這有助於瞭解整個進化的過程，內部代謝網路是如何變化的。這可以提供更多值得學習的價值，同時提供更多未來理性設計的思路。（當然這個需要大量的科研經費，很燒錢）
今年在Nature Communication上發表了一篇也是實驗室進化（進化了60多天，使一個慢速生長細菌的生長速度變得越來越快）的文章[3]，其中就對進化過程以及組學數據進行了詳細的分析，我曾經在組會上對其進行了解讀。所以我認為這篇Cell文章在後續的工作可以進行更加詳細的分析，挖掘更加豐富的信息。
3. 進化的結果看似炫酷，但是長時間的等待是枯燥和令人痛苦的
- 400天的進化，在200天才看到明顯的結果，這樣的過程我想一定很煎熬的
- 我在實驗室中也做過很多進化，雖然和本文章的試驗方法不同，但是我進化的時間往往只有幾十個小時，最多所有時間加起來只有2周的時間。有的時間我會得到很多進化出來的突變體，但是有的時間得不到，進而就放棄了。
- 但是作者進行進化了超過1年的時間，這的確讓人佩服。這個過程需要非常詳細的實驗設計以確保長時間的實驗能夠完整流暢的進行，同時也需要超乎常人的毅力和決心：相信進化這個生物最強大的功能可以帶來想要的未來。
4. 這篇文章也讓我想到前段時間讀過的一篇Nature子刊文章[4]——細胞霸權：相比於計算機，生命最強大的地方在於哪裡？
https://www.nature.com/articles/s41467-019-13232-z?www.nature.com我們都知道量子霸權，即量子計算機實現霸權後可以在極短的時間內解決傳統計算機需要近萬年時間才能解決的問題。
細胞霸權也是如此。合成生物學一直將生命比作一種高級的機器，一種高級的計算機。通過這種比喻，合成生物學也在電路系統、工程的各種理念引入到細胞之中，比如過於強調理性設計，構建各種邏輯基因電路、可預測、正交化等等思路。但是這種思路在經過20年的發展之後，取得了一定的成功，但是也面臨著更多的瓶頸。
這種思路在一定程度也限制合成生物學對於生命的理解，總會有人問一句：這件事情上傳統計算機能夠做，為什麼還要在細胞中做一遍嗎（比如邏輯運算）？誠然，這當然是非常有用的，通過讓細胞進行邏輯運算可以使其作為工程機器治療複雜的癌症，在人體內檢測不同的身體狀態。
但是如何才能發揮生命的最大用處，相比如傳統計算機，細胞或者生命的「霸權」在哪裡？也就是其特殊性以及優越性在哪裡？
在這篇關於「細胞霸權」的文章中，其中作者提到了細胞在計算上的霸權所在之處：
- Reconfigurability 可重構性: 細胞能夠根據外界信號改變自身的內部結構（這一點經典的計算機在運行演算法上是固定的，無法改變）
- Noise 雜訊: 不僅能夠容忍而且能夠利用生物學上「混亂」的能力（傳統計算機強調運行環境要清楚明確）
- Cocurrency 並發: 促進大規模並行通信和協調的細胞間過程的多樣性和豐富性
- Representation 表示: 對信號使用非二進位表示的能力
- Evolution 進化: 隨著時間的推移，在羣體層面尋求新穎解決方案的能力
這篇發表在Cell的文章正好直接突出了以上的第五條和第一條。作者利用進化使細胞獲得了全新的功能，同時在進化的過程中細胞重塑內部的關聯：重塑了碳代謝相關的關鍵途徑。
我想雖然這項工作目前的實際價值並不會很快顯示出來，但是其給與我很大的震撼。進化的可塑性是遠超人們想像的。
合成生物學在未來的研究中似乎還可以更加大膽一些！
參考
- ^https://en.wikipedia.org/wiki/Autotroph
- ^https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867419312309?via%3Dihub
- ^https://www.nature.com/articles/s41467-019-08888-6
- ^https://www.nature.com/articles/s41467-019-13232-z
謝 @schweine鹹 邀請。
先談談總結：
Ron Milo教授研究團隊以大腸桿菌為研究對象，以卡爾文循環為代謝基礎，以適應性進化為優化工具最終實現了大腸桿菌從異養代謝向自養代謝的轉化，打破了不同生物類型之間的「次元壁」。這一工作的意義還在於為我們今後直接利用大氣中的CO2來合成食物，燃料以及其他生物分子提供了可能性，尤其對於溫室效應越來越嚴重的今天而言，這項研究讓人興奮。
然而，Ron Milo教授也提出這項工作目前的不足之處，由於體系中的自養型大腸桿菌需要將甲酸鈉氧化成CO2來供能，且產生CO2速率要高於其吸收的速率，所以實際上系統中CO2是凈增加的，因此未來可能需要偶聯一個可再生能源途徑去將CO2再合成甲酸鈉或者尋找其他化合物替代fomrate為體系供能。
以下為對該研究的具體解讀。
自接觸生物科學以來，我們就被告知自然界的生物可以分為三類：以植物為主的「生產者」，以動物為主的「消費者」和以微生物為主的「消費者」。隨著對生物科學的深入瞭解，我們知道這些生物其實可以簡單的分為兩類：可以將CO2轉化為有機物的自養生物(autotrophs)和以分解有機物為生的異養生物(heterotrophs)。因此，界定這兩種生物唯一的標準就是判斷其是否是利用CO2作為單一碳源。很長一段時間以來，科學家們一直努力嘗試在實驗室條件下將已知的異養生物轉變成自養生物【1,2】，因為這不僅能幫助我們更好的理解自養生物的生存法則，此外，在構建自養生物的過程中，我們可以認識到自然界中的自養生物在自養代謝過程中的限制因素是什麼，並以此來尋求方法去促進這一過程並實現無機碳源向有機物轉換的可持續性。
自然界目前已知的有五種固碳途徑：
卡爾文循環（Calvin-Benson-Bassham cycle ，CBB）、
還原性三羧酸循環(rTCA)、
還原性乙醯輔酶A途徑（W-L循環）、
3-羥基丙酸/4-羥基丁酸（3HP/4HB）、
3-羥基丙酸、二羧酸/4-羥基丁酸（DC/4HB）。
其中最普遍的CO2固定途徑是卡爾文循環，它廣泛的存在於綠色植物體、藍細菌、藻類、紫色細菌和一些變形菌中【3】。儘管科學家們已經在大腸桿菌中以卡爾文循環為代謝基礎取得了巨大的進步，但遺憾的是一直沒能取得最後的成功。
2019年11月28日，來自以色列威茨曼科學研究所的Ron Milo教授與其合作者們在這一領域取得重大突破，在Cell雜誌上發表了題為Conversion of Escherichia coli to Generate All Biomass Carbon from CO2的研究，報道了他們首次在實驗室內構建出只利用CO2作為唯一碳源的自養型大腸桿菌的研究成果。
為了構建出自養型大腸桿菌，作者將這一艱巨的任務拆分成三個部分：
第一，CO2隻能作為唯一的碳源,並參與核心代謝用於合成12種生物大分子前體；
第二，在在大腸桿菌內過表達一套酶系統，該系統可以通過非化學能量諸如光、電等或者通過氧化非碳源的還原性化學物來獲取還原力(reducing power，指生物氧化還原反應中產生的作為還原劑的高能化合物，如NADH、NADPH等)；
第三，必須要協調好CO2固定和能量獲取這兩個過程從而使得大腸桿菌能夠穩定利用CO2作為唯一碳源生長。
這裡值得一提的是，已有研究中，包括作者之前的研究，已經能夠利用CO2作為碳源來維持大腸桿菌的生長，但可惜的是這一過程需要添加額外的碳源【1】。
為瞭解決這一難題，作者首先選用甲酸鈉作為電子供體用於固定CO2,因為甲酸鈉不僅可以提供還原力，並且在自然條件下不會被大腸桿菌作為碳源利用。為了將甲酸鈉中的還原力釋放出來，作者需要在大腸桿菌中過表達一套酶系統，包括甲酸脫氫酶(FDH), 二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)以及磷酸核酮糖激酶（phosphoribulo-kinase）。然而，在大腸桿菌中過表達了這三種重組酶並不能使得其在自養條件下進行生長。
於是作者決定利用實驗室適應進化（adaptive laboratory evolution）的方法作為優化工具去獲得完全自養的大腸桿菌。作者認為，實驗失敗的根本原因在於大腸桿菌本身是異養生物，所以其代謝流分配主要還是適應異養生長。
因此，作者首先通過敲除碳源代謝兩個關鍵酶—磷酸果糖激酶（phosphofructokinase）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate-dehydrogenase）對大腸桿菌進行代謝重編程並使得其在以木糖為碳源的條件下依賴二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)的脫羧作用。緊接著，在此基礎上再去過表達甲酸脫氫酶(FDH), 二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)以及磷酸核酮糖激酶（phosphoribulo-kinase）。最後，作者將改造後的大腸桿菌培養在木糖限制的恆化器中，使得大腸桿菌在能夠維持生長的同時始終處於碳源飢餓的狀態，從而保持一定的選擇壓力促進進化過程的發生。見下圖。
經過約350天的實驗室適應進化實驗，作者完全撤掉了體系中的木糖並持續檢測大腸桿菌的生長情況，結果表明大腸桿菌依舊可以正常生長。此外，作者利用C13標記的同位素實驗證明，這些大腸桿菌只利用CO2作為唯一的碳源，這說明作者構建出了完全自養型大腸桿菌。
為了更好的闡述大腸桿菌在異養到自養轉變過程的遺傳基礎，作者對這一過程不同時段的大腸桿菌菌株的基因組和質粒進行測序。作者將檢測到的基因突變分成三個大類，第一類突變基因與卡爾文循環直接相關，總的來說，自養型大腸桿菌包含不止一個代謝分流點（flux branch point）的突變。第二類突變基因與之前實驗室適應進化實驗觀測到的突變一致。第三類突變基因是一些當前未知功能的突變，因此需要後續的實驗來證明其對大腸桿菌自養轉變過程是否是必需的。
綜上，Ron Milo教授研究團隊以大腸桿菌為研究對象，以卡爾文循環為代謝基礎，以適應性進化為優化工具最終實現了大腸桿菌從異養代謝向自養代謝的轉化，打破了不同生物類型之間的「次元壁」。這一工作的意義還在於為我們今後直接利用大氣中的CO2來合成食物，燃料以及其他生物分子提供了可能性，尤其對於溫室效應越來越嚴重的今天而言，這項研究讓人興奮。
然而，Ron Milo教授也提出這項工作目前的不足之處，由於體系中的自養型大腸桿菌需要將甲酸鈉氧化成CO2來供能，且產生CO2速率要高於其吸收的速率，所以實際上系統中CO2是凈增加的，因此未來可能需要偶聯一個可再生能源途徑去將CO2再合成甲酸鈉或者尋找其他化合物替代fomrate為體系供能。
標題"Conversion of Escherichia coli to Generate All Biomass Carbon from CO2" 強調的是使用二氧化碳作為所有的合成產物的碳源, 看圖3B的同位素標記實驗, 甲酸鹽代謝出來的二氧化碳不會進入再循環, 考慮到大腸桿菌不一定有植物細胞裡面那麼多細胞器結構隔離各種反應, 還是挺有意思的.
個人覺得只是秀一下合成生物學的本事, 應用價值一般般, 尤其是考慮到甲酸鹽消耗以後其實是生成二氧化碳的.
固定二氧化碳算是光合作用裡面的暗反應, 還原劑 (NADH等等) 還需要通過人工添加還原劑 (甲酸鹽) 來實現, 而氧化甲酸鹽又會生成二氧化碳. 什麼時候能搞定光反應直接纔是NB, 但是藍藻綠藻植物那麼多物種能搞掂光反應, 你們折騰大腸桿菌幹什麼? // 等哪天他們真的弄出來個能光合作用的大腸桿菌我要審計他們的數據確認他們沒有把葉綠體裝進大腸桿菌
某雙非一本生物工程學在讀博士強答一發~
主要是釋放下個人的想法，為了避免一些不必要的爭執，就匿名了。
我個人覺得這個工作還是非常了不起的！是個很棒的工作。
讀完這篇文章以後我個人有了一些想法：
首先，生物除了碳源之外，還是需要還原力的，原本的葡萄糖自身就具備還原力，然而二氧化碳難以用於還原生物小分子，畢竟二氧化碳裏的電子基本都在氧手裡，氧對電子的吸附能力太強，對生物體來說，氧的電子用於還原太難，作者考慮到了這一點，於是補充了甲酸來提供還原力。
其次，生物真的是越來越像機器了，具備了功能模塊，就能執行相應功能，這項研究，佐證了這一點，我覺得非常了不起~
最後，我個人一直覺得，有一個問題如果不解決，我們這些生命科學研究者就很難真正的全面的掌控生命。那個問題就是細胞是如何做到基於基因的時序性表達繼而控制自身的增殖的。細胞感知環境機理很多得到了解釋，但是細胞自身是如何意識到自己該增殖了，並且通過代謝調控完成增殖，這始終是個困擾我的問題。我甚至覺得，生物化學這本書上，其實還有一個很重要的章節，至今沒人能寫，那個章節，就是基因的時序性調控（關於基因的時序性調控不是沒有相關的研究，只是據我所知，目前關於生物鐘研究主要還是集中在生物的行為節律上，而非細胞自身的增殖節律，所以關於細胞的增值節律，我個人一直在期待出現相關的研究）。
感謝那些了不起的以色列科學家的工作，真是非常漂亮的工作！
合成糧食人造肉，以後去火星就喫這個了。在地球也可以用來做飼料，煤變豬。
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