多形性胶质母细胞瘤(GBM)是最常见的原发性脑肿瘤，中位生存期大约只有1年。这主要是因为肿瘤被切除后会复发。确切地说，肿瘤复发的机理还不是很清楚。科学工作者们用一个小鼠基因工程模型，发现了脑胶质瘤中的一群神秘的「内源性的肿瘤细胞」。在使用替莫唑胺（TMZ）暂时性地抑制了肿瘤生长后，这群细胞就是新肿瘤细胞的增殖之源。

小鼠模型的建立

科学工作者们研究了一系列小鼠品系。这些小鼠品系带有肿瘤抑制基因的条件等位基因,例如NF1, p53和Pten的条件等位基因，可以自发地形成恶性脑肿瘤，并且有100%外显率。这些肿瘤细胞源于脑室下区（subventricular zone， SVZ）。科学家工作者们由此提出，这些肿瘤很可能就是发源于成年的神经干细胞(Neural Stem Cells, NSCs)。

Nestin-ΔTK-IRES-GFP 转基因

Nestin-ΔTK-IRES-GFP 转基因最初是用来标记成年神经干细胞的。如图。

  • Nestin promotor：巢蛋白启动子。巢蛋白为神经干细胞的特征性标志物。肿瘤干细胞也会表达巢蛋白，巢蛋白可以作为部分肿瘤干细胞的标志物。巢蛋白启动子可以专性地驱动下游基因在神经干细胞中表达。
  • HSV-ΔTK: 经修饰过的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase, HSV-TK)。它可以调控药物ganciclovir(GCV)的磷酸化，使分裂中的神经祖细胞(neural progeniors)凋亡。单纯疱疹病毒胸苷激酶作用于GCV，使细胞凋亡的机理如图。
  • IRES：内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site, IRES)。IRES序列编码的是一个RNA原件。由于它特殊的二级结构，它可以将真核生物的核糖体导入mRNA进行蛋白质的合成。这一蛋白质合成的起始过程不需要起始复合物识别5』帽子结构。分子生物学家们将IRES序列插入表达载体使两个基因可以在同一载体上表达。例如一个HSV-ΔTK和一个绿色荧光蛋白(GFP)。前者的蛋白合成靠识别5』帽子结构，而后者依赖IRES结构。
  • GFP：绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)，基因表达的报告器。

为了证实被GCV激活的Nestin-ΔTK-IRES-GFP 转基因可有效地根除内源性的神经干/近端祖细胞，科学工作者们对Nestin-ΔTK-IRES-GFP 转基因小鼠连续量星期皮下注射GCV。然后对小鼠脑室下区免疫荧游标记,实验结果如下：

A. 野生型小鼠皮下注射GCV

B. Nestin-ΔTK-IRES-GFP 转基因小鼠皮下注射磷酸缓冲液

C. Nestin-ΔTK-IRES-GFP 转基因小鼠皮下注射GCV

  • 绿色荧光是绿色荧光蛋白(GFP)发出的。GFP在神经干细胞的表达，标志著Nestin-ΔTK-IRES-GFP 转基因在神经干细胞中表达。
  • 蓝色荧游标记的是胶质细胞原纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP)。GFAP是静止状态，未分裂的神经干细胞的标志物。
  • 红色荧游标记的是神经元迁移蛋白双蛋白(DCX)。神经干细胞增殖后的细胞是神经干细胞和神经祖细胞的中间体。中间体细胞又进一步成为神经祖细胞。这些细胞表达DCX，具有分裂的能力，并且神经分化的能力逐渐增加，但是不表达GFAP和Nestin。也就是说，在这个实验中，绿色荧光和红色荧光不会重叠，蓝色荧光和红色荧光也不会重叠。如图。

这三种荧游标记了脑室下区的干细胞龛（stem cell niche）中的细胞。

在荧光照片A中，由于是野生型小鼠，没有Nestin-ΔTK-IRES-GFP 转基因，因此不显示绿色荧光。GCV也对其无影响。

在荧光照片B中，白色箭头指示，DCX-阳性而GFP-阴性的细胞较集中在喙侧迁移流(rostral migratory stream, RMS)的末梢。Nestin-ΔTK-IRES-GFP 转基因小鼠皮下注射磷酸缓冲液（PBS）对其无影响。

而在荧光照片C中，Nestin-ΔTK-IRES-GFP 转基因小鼠腹腔内注射GCV后，在照片中只能看到GFP- 阳性/GFAP-阳性但DCX-阴性的静止状态的神经干细胞。这写照片说明，在GCV存在的情况下，HSV-TK只靶向分裂增殖中的神经祖细胞，使其凋亡。而GFAP-阳性的神经干细胞，由于处于未分裂的静止状态，不受影响。这些神经干细胞同时也表达转基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP，因此也显示GFP- 阳性。

这一实验结果表明，转基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP特意性地在脑室下区静止未分裂神经干细胞以及早期的中间祖细胞中表达。持续性地对小鼠皮下注射GCV，可有效地阻断神经发生（neurogenesis）。因为当静止的神经干细胞开始增殖，进入细胞周期的时候，它们就会因在HSV-TK作用下磷酸化的GCV掺入DNA而凋亡。

培育带有转基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP 和肿瘤抑制基因的条件等位基因的小鼠

科学家们首先想知道的是这一转基因结构是否可以用来标记内源性的神经胶质瘤细胞。他们将hGFAP-Cre; P53^{flox/flox} 的雄性小鼠与 NF1_{}^{flox/flox}; P53^{flox/flox}; Pten^{flox/flox}; Nestin-ΔTK-IRES-GFP的雌性小鼠杂交，得到了Mut7小鼠。如图。

Mut7小鼠的基因型为hGFAP-Cre; NF1^{flox/+}; P53^{flox/flox}; Pten^{flox/+}; Nestin-ΔTK-IRES-GFP。

  • hGFAP-Cre:hGFAP是人脑胶质酸性蛋白转录启动子。它可以使下游的基因专性地在中枢神经系统中表达。Cre是指 P1噬菌体的重组酶。它识别DNA上LoxP序列，在两个LoxP位点之间催化位点特意性重组。Cre-LoxP重组的原理如图。

hGFAP-Cre结构使Cre-LoxP重组专性地在脑中发生。

  • P53^{flox/flox} :在遗传学中, 「flox」 指的是DNA的序列夹在两个LoxP位点之间。 P53^{flox/flox} 指的是小鼠的两个p53的等位基因都被夹在两个LoxP位点之间。因此hGFAP转录启动子专性地在中枢神经系统中驱动Cre重组酶催化两个LoxP位点之间的重组，将p53基因剔除掉。而其他组织中，p53依然正常表达。如图。

  • NF1^{flox/+} ,Pten^{flox/+} :「flox/+」指的是NF1和Pten的两个等位基因中只有一个是被夹在LoxP位点之间，可在中枢神经系统中被剔除，而另一个等位基因是野生型。

由于在中枢神经系统中，肿瘤抑制基因p53不表达，NF1和Pten不完全地表达，在小鼠脑部便自发地形成肿瘤。

在神经胶质瘤中有「一群」肿瘤细胞表达转基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP

下图为Mut7（hGFAP-Cre; NF1^{flox/+}; P53^{flox/flox}; Pten^{flox/+}; Nestin-ΔTK-IRES-GFP）小鼠自发形成的肿瘤。

  • GFP: 绿色荧光表示转基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP的表达。由于Nestin-ΔTK-IRES-GFP可在静止的，未分裂的神经干细胞中表达，此处绿色荧游标记的可能是静止状态的肿瘤干细胞。
  • TOPO-3: 蓝色荧游标记细胞的拓扑异构酶。由于拓扑异构酶总是在细胞核中大量表达，在此，蓝色荧游标记了所有肿瘤细胞。
  • Ki67: Ki67是一种细胞核蛋白，由于它与细胞增殖密切相关，它被作为增殖中的细胞的标记。此处，红色荧游标记了增殖中的肿瘤细胞。

实验结果显示，所有的Mut7; Nestin-ΔTK-IRES-GFP小鼠都自发地形成了神经胶质瘤，然而只有一部分的肿瘤细胞表达了GFP，呈绿色荧光，见肿瘤1-4。科学工作者们接著检测了肿瘤增殖的情况。他们发现，Mut7; Nestin-ΔTK-IRES-GFP转基因的肿瘤中有相当一部分肿瘤细胞呈现了Ki67-阳性/GFP-阴性，而GFP-阳性的细胞几乎都是Ki67-阴性（由白色箭头表示）。这一结果进一步说明，在脑室下区，几乎所有的表达转基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP（呈现绿色荧光）的肿瘤细胞与那些活跃增殖的表达Ki67（呈现红色荧光）的肿瘤细胞相比是处于较为静止的状态。也就是说，GFP-阳性的肿瘤干细胞与GFP-阴性的细胞相比是处于相对静止的状态。

替莫唑胺靶向增殖中的肿瘤细胞

替莫唑胺是DNA烷化剂，它是多形性胶质母细胞瘤（GBM）术后化疗的主要药物，因为它可暂时性地抑制肿瘤的生长。Mut7; Nestin-ΔTK-IRES-GFP小鼠连续5天腹腔内注射替莫唑胺。而对照组小鼠腹腔注射的是DMSO(替莫唑胺的溶剂)。最后一次替莫唑胺/DMSO注射2小时后，注射BrdU。再经过2小时，小鼠被灌流。实验流程和结果如图。

  • BrdU: BrdU是核苷胸苷的类似物，通常被用来标记增殖中的细胞。在DNA复制合成中的细胞，它可以掺入新合成的DNA中。BrdU特意性的抗体被用来检测掺入DNA的BrdU。此处的BrdU特意性的抗体显示红色荧光。
  • GFAP：胶质细胞原纤维酸性蛋白，标记的是静止状态，未分裂的肿瘤干细胞。

实验结果显示，注射替莫唑胺的小鼠的肿瘤细胞，BrdU-阳性的细胞明显比注射了DMSO的对照组小鼠减少。这证实了，替莫唑胺确实能消灭增殖中的内源性的神经胶质瘤细胞。

然而，为什么经替莫唑胺化疗后，肿瘤复发是不可避免的呢？

表达Nestin-ΔTK-IRES-GFP的干细胞是神经胶质瘤复发之源

为了找出答案，科学工作者们又进行了以下的实验。

Mut7;Nestin-ΔTK-IRES-GFP小鼠连续5天腹腔内注射替莫唑胺，然后分别在1天和3天之后腹腔内注射CldU和IdU。CldU和IdU是BrdU的类似物。它们同样在DNA复制合成过程中，可以掺入新合成的DNA中，通常被用来标记增殖中的细胞。实验结果如下图。

科学工作者们发现了一些CldU-阳性或IdU阳性的肿瘤细胞，照片中用蓝色箭头表示。这些细胞是处于增殖状态中的肿瘤细胞，而这些细胞竟然也是GFP-阳性。这说明原来表达转基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP的处于静止未分裂状态的一些肿瘤干细胞，由于它们不分裂，因此在替莫唑胺处理的5天的过程中，它们侥幸「逃过」了。之后，这些原来处于静止状态的肿瘤细胞便开始分裂，渐渐失去了干细胞的特性。当科学工作者们将小鼠腹腔注射IdU延长到替莫唑胺处理后的7天时，发现大多数CldU-阳性的肿瘤细胞已经不表达GFP，成为了GFP-阴性。此时的转基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP细胞已经完全失去了干细胞的特性，完全进入增殖状态，使肿瘤重新开始生长。

总结这个实验的结果就是，科学工作者们用转基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP标记了神经胶质瘤干细胞，并且「跟踪」了肿瘤内细胞的分裂情况。他们发现了一群表达Nestin-ΔTK-IRES-GFP的细胞。这群细胞处于静止的未分裂的状态，具有干细胞的特性，因此它们不被替莫唑胺「消灭」。这些细胞正是神经胶质瘤复发之源。

那么，科学工作者们假设，只要能消灭肿瘤中GFP-阳性的细胞，便可有效地降低肿瘤复发。为了证实这一假说，科学工作者们进行了以下的实验。

GCV组小鼠的存活率明显高于生理盐水组。这说明，当GCV有效地根除Nestin-ΔTK-IRES-GFP阳性的细胞后，肿瘤的进一步发展被阻断，小鼠的生存期明显地延长。

联合使用替莫唑胺和GCV以根除快速增殖中的和静止状态的肿瘤细胞

科学工作者们预言，如果对Mut7;Nestin-ΔTK-IRES-GFP小鼠联合使用替莫唑胺和GCV，将最大程度地杀死肿瘤细胞。

Mut7;Nestin-ΔTK-IRES-GFP小鼠连续5天腹腔内注射替莫唑胺，在最后一次注射替莫唑胺之后两天，皮下注射GCV。如图。

然后科学工作者们对小鼠脑背侧残留的肿瘤进行检测，发现联合注射了替莫唑胺和GCV之后，GFP的表达几乎完全消失。这说明GFP-阳性的细胞几乎全部被根除。如图。

而且，从图中也可看到，注射了替莫唑胺和GCV之后的残余肿瘤的细胞密度跟对照相比大大地降低。这说明肿瘤体积明显地缩小。然而，令人不解的是，虽然联合使用替莫唑胺和GCV与使用磷酸缓冲液和单独使用替莫唑胺相比，小鼠的生存期延长；但是联合使用替莫唑胺和GCV与单独使用GCV相比，并没有延长小鼠的生存期。如图。

科学工作者们进一步对注射了替莫唑胺/GCV的小鼠的脑进行了分析研究。发现，尽管原始肿瘤的生长被显著抑制，但是在这些小鼠的腹侧脑区产生了新的肿瘤。大部分注射了替莫唑胺/GCV的小鼠，它们的肿瘤都在脑干区。而未处理的对照组小鼠，它们的肿瘤在背/中脑。科学家们对这一现象科学工作者们正在做进一步研究。

在这一研究中，科学工作者们用Nestin-ΔTK-IRES-GFP转基因标记了室管膜下区神经干细胞。非常偶然地，科学工作者发现Nestin-ΔTK-IRES-GFP转基因同时也可标记多型性胶质母细胞瘤肿瘤细胞群中的一个特殊的「亚群」细胞，这个细胞亚群具有肿瘤干细胞的特征。肿瘤干细胞假说认为，肿瘤是由一群「等级森严的细胞」组成的，其中只有一个「亚群」的细胞同时保持著自我更新和分化的能力。在这个实验模型中，只有肿瘤干细胞有能力维持肿瘤的不断生长，并且造成治疗后的复发。这项研究确定了一种内源性胶质瘤细胞，科学工作者们假定它们就是内源性胶质瘤的干细胞。在肿瘤细胞等级中，它们处在「顶端」位置，如图，维持著肿瘤的不断生长和造成化疗后的复发。

在接下来的工作中，科学工作者们将进一步对这群细胞进行分离和遗传谱系追踪。它们可能成为治疗神经胶质瘤的新的靶标。

Reference

1. J. Chen et al., A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature 488, 522-526 (2012).

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3. J. Zhang, J. Jiao, Molecular Biomarkers for Embryonic and Adult Neural Stem Cell and Neurogenesis. Biomed Res Int 2015, 727542 (2015).

4. L. Zhuo et al., hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis 31, 85-94 (2001).

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