多形性膠質母細胞瘤(GBM)是最常見的原發性腦腫瘤，中位生存期大約只有1年。這主要是因為腫瘤被切除後會複發。確切地說，腫瘤複發的機理還不是很清楚。科學工作者們用一個小鼠基因工程模型，發現了腦膠質瘤中的一羣神祕的「內源性的腫瘤細胞」。在使用替莫唑胺（TMZ）暫時性地抑制了腫瘤生長後，這羣細胞就是新腫瘤細胞的增殖之源。

小鼠模型的建立

科學工作者們研究了一系列小鼠品系。這些小鼠品系帶有腫瘤抑制基因的條件等位基因,例如NF1, p53和Pten的條件等位基因，可以自發地形成惡性腦腫瘤，並且有100%外顯率。這些腫瘤細胞源於腦室下區（subventricular zone， SVZ）。科學家工作者們由此提出，這些腫瘤很可能就是發源於成年的神經幹細胞(Neural Stem Cells, NSCs)。

Nestin-ΔTK-IRES-GFP 轉基因

Nestin-ΔTK-IRES-GFP 轉基因最初是用來標記成年神經幹細胞的。如圖。

  • Nestin promotor：巢蛋白啟動子。巢蛋白為神經幹細胞的特徵性標誌物。腫瘤幹細胞也會表達巢蛋白，巢蛋白可以作為部分腫瘤幹細胞的標誌物。巢蛋白啟動子可以專性地驅動下游基因在神經幹細胞中表達。
  • HSV-ΔTK: 經修飾過的單純皰疹病毒胸苷激酶(Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase, HSV-TK)。它可以調控藥物ganciclovir(GCV)的磷酸化，使分裂中的神經祖細胞(neural progeniors)凋亡。單純皰疹病毒胸苷激酶作用於GCV，使細胞凋亡的機理如圖。
  • IRES：內部核糖體進入位點(Internal Ribosome Entry Site, IRES)。IRES序列編碼的是一個RNA原件。由於它特殊的二級結構，它可以將真核生物的核糖體導入mRNA進行蛋白質的合成。這一蛋白質合成的起始過程不需要起始複合物識別5』帽子結構。分子生物學家們將IRES序列插入表達載體使兩個基因可以在同一載體上表達。例如一個HSV-ΔTK和一個綠色熒光蛋白(GFP)。前者的蛋白合成靠識別5』帽子結構，而後者依賴IRES結構。
  • GFP：綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)，基因表達的報告器。

為了證實被GCV激活的Nestin-ΔTK-IRES-GFP 轉基因可有效地根除內源性的神經幹/近端祖細胞，科學工作者們對Nestin-ΔTK-IRES-GFP 轉基因小鼠連續量星期皮下注射GCV。然後對小鼠腦室下區免疫熒遊標記,實驗結果如下：

A. 野生型小鼠皮下注射GCV

B. Nestin-ΔTK-IRES-GFP 轉基因小鼠皮下注射磷酸緩衝液

C. Nestin-ΔTK-IRES-GFP 轉基因小鼠皮下注射GCV

  • 綠色熒光是綠色熒光蛋白(GFP)發出的。GFP在神經幹細胞的表達，標誌著Nestin-ΔTK-IRES-GFP 轉基因在神經幹細胞中表達。
  • 藍色熒遊標記的是膠質細胞原纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP)。GFAP是靜止狀態，未分裂的神經幹細胞的標誌物。
  • 紅色熒遊標記的是神經元遷移蛋白雙蛋白(DCX)。神經幹細胞增殖後的細胞是神經幹細胞和神經祖細胞的中間體。中間體細胞又進一步成為神經祖細胞。這些細胞表達DCX，具有分裂的能力，並且神經分化的能力逐漸增加，但是不表達GFAP和Nestin。也就是說，在這個實驗中，綠色熒光和紅色熒光不會重疊，藍色熒光和紅色熒光也不會重疊。如圖。

這三種熒遊標記了腦室下區的幹細胞龕（stem cell niche）中的細胞。

在熒光照片A中，由於是野生型小鼠，沒有Nestin-ΔTK-IRES-GFP 轉基因，因此不顯示綠色熒光。GCV也對其無影響。

在熒光照片B中，白色箭頭指示，DCX-陽性而GFP-陰性的細胞較集中在喙側遷移流(rostral migratory stream, RMS)的末梢。Nestin-ΔTK-IRES-GFP 轉基因小鼠皮下注射磷酸緩衝液（PBS）對其無影響。

而在熒光照片C中，Nestin-ΔTK-IRES-GFP 轉基因小鼠腹腔內注射GCV後，在照片中只能看到GFP- 陽性/GFAP-陽性但DCX-陰性的靜止狀態的神經幹細胞。這寫照片說明，在GCV存在的情況下，HSV-TK只靶向分裂增殖中的神經祖細胞，使其凋亡。而GFAP-陽性的神經幹細胞，由於處於未分裂的靜止狀態，不受影響。這些神經幹細胞同時也表達轉基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP，因此也顯示GFP- 陽性。

這一實驗結果表明，轉基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP特意性地在腦室下區靜止未分裂神經幹細胞以及早期的中間祖細胞中表達。持續性地對小鼠皮下注射GCV，可有效地阻斷神經發生（neurogenesis）。因為當靜止的神經幹細胞開始增殖，進入細胞週期的時候，它們就會因在HSV-TK作用下磷酸化的GCV摻入DNA而凋亡。

培育帶有轉基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP 和腫瘤抑制基因的條件等位基因的小鼠

科學家們首先想知道的是這一轉基因結構是否可以用來標記內源性的神經膠質瘤細胞。他們將hGFAP-Cre; P53^{flox/flox} 的雄性小鼠與 NF1_{}^{flox/flox}; P53^{flox/flox}; Pten^{flox/flox}; Nestin-ΔTK-IRES-GFP的雌性小鼠雜交，得到了Mut7小鼠。如圖。

Mut7小鼠的基因型為hGFAP-Cre; NF1^{flox/+}; P53^{flox/flox}; Pten^{flox/+}; Nestin-ΔTK-IRES-GFP。

  • hGFAP-Cre:hGFAP是人腦膠質酸性蛋白轉錄啟動子。它可以使下游的基因專性地在中樞神經系統中表達。Cre是指 P1噬菌體的重組酶。它識別DNA上LoxP序列，在兩個LoxP位點之間催化位點特意性重組。Cre-LoxP重組的原理如圖。

hGFAP-Cre結構使Cre-LoxP重組專性地在腦中發生。

  • P53^{flox/flox} :在遺傳學中, 「flox」 指的是DNA的序列夾在兩個LoxP位點之間。 P53^{flox/flox} 指的是小鼠的兩個p53的等位基因都被夾在兩個LoxP位點之間。因此hGFAP轉錄啟動子專性地在中樞神經系統中驅動Cre重組酶催化兩個LoxP位點之間的重組，將p53基因剔除掉。而其他組織中，p53依然正常表達。如圖。

  • NF1^{flox/+} ,Pten^{flox/+} :「flox/+」指的是NF1和Pten的兩個等位基因中只有一個是被夾在LoxP位點之間，可在中樞神經系統中被剔除，而另一個等位基因是野生型。

由於在中樞神經系統中，腫瘤抑制基因p53不表達，NF1和Pten不完全地表達，在小鼠腦部便自發地形成腫瘤。

在神經膠質瘤中有「一羣」腫瘤細胞表達轉基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP

下圖為Mut7（hGFAP-Cre; NF1^{flox/+}; P53^{flox/flox}; Pten^{flox/+}; Nestin-ΔTK-IRES-GFP）小鼠自發形成的腫瘤。

  • GFP: 綠色熒光表示轉基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP的表達。由於Nestin-ΔTK-IRES-GFP可在靜止的，未分裂的神經幹細胞中表達，此處綠色熒遊標記的可能是靜止狀態的腫瘤幹細胞。
  • TOPO-3: 藍色熒遊標記細胞的拓撲異構酶。由於拓撲異構酶總是在細胞核中大量表達，在此，藍色熒遊標記了所有腫瘤細胞。
  • Ki67: Ki67是一種細胞核蛋白，由於它與細胞增殖密切相關，它被作為增殖中的細胞的標記。此處，紅色熒遊標記了增殖中的腫瘤細胞。

實驗結果顯示，所有的Mut7; Nestin-ΔTK-IRES-GFP小鼠都自發地形成了神經膠質瘤，然而只有一部分的腫瘤細胞表達了GFP，呈綠色熒光，見腫瘤1-4。科學工作者們接著檢測了腫瘤增殖的情況。他們發現，Mut7; Nestin-ΔTK-IRES-GFP轉基因的腫瘤中有相當一部分腫瘤細胞呈現了Ki67-陽性/GFP-陰性，而GFP-陽性的細胞幾乎都是Ki67-陰性（由白色箭頭表示）。這一結果進一步說明，在腦室下區，幾乎所有的表達轉基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP（呈現綠色熒光）的腫瘤細胞與那些活躍增殖的表達Ki67（呈現紅色熒光）的腫瘤細胞相比是處於較為靜止的狀態。也就是說，GFP-陽性的腫瘤幹細胞與GFP-陰性的細胞相比是處於相對靜止的狀態。

替莫唑胺靶向增殖中的腫瘤細胞

替莫唑胺是DNA烷化劑，它是多形性膠質母細胞瘤（GBM）術後化療的主要藥物，因為它可暫時性地抑制腫瘤的生長。Mut7; Nestin-ΔTK-IRES-GFP小鼠連續5天腹腔內注射替莫唑胺。而對照組小鼠腹腔注射的是DMSO(替莫唑胺的溶劑)。最後一次替莫唑胺/DMSO注射2小時後，注射BrdU。再經過2小時，小鼠被灌流。實驗流程和結果如圖。

  • BrdU: BrdU是核苷胸苷的類似物，通常被用來標記增殖中的細胞。在DNA複製合成中的細胞，它可以摻入新合成的DNA中。BrdU特意性的抗體被用來檢測摻入DNA的BrdU。此處的BrdU特意性的抗體顯示紅色熒光。
  • GFAP：膠質細胞原纖維酸性蛋白，標記的是靜止狀態，未分裂的腫瘤幹細胞。

實驗結果顯示，注射替莫唑胺的小鼠的腫瘤細胞，BrdU-陽性的細胞明顯比注射了DMSO的對照組小鼠減少。這證實了，替莫唑胺確實能消滅增殖中的內源性的神經膠質瘤細胞。

然而，為什麼經替莫唑胺化療後，腫瘤複發是不可避免的呢？

表達Nestin-ΔTK-IRES-GFP的幹細胞是神經膠質瘤複發之源

為了找出答案，科學工作者們又進行了以下的實驗。

Mut7;Nestin-ΔTK-IRES-GFP小鼠連續5天腹腔內注射替莫唑胺，然後分別在1天和3天之後腹腔內注射CldU和IdU。CldU和IdU是BrdU的類似物。它們同樣在DNA複製合成過程中，可以摻入新合成的DNA中，通常被用來標記增殖中的細胞。實驗結果如下圖。

科學工作者們發現了一些CldU-陽性或IdU陽性的腫瘤細胞，照片中用藍色箭頭表示。這些細胞是處於增殖狀態中的腫瘤細胞，而這些細胞竟然也是GFP-陽性。這說明原來表達轉基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP的處於靜止未分裂狀態的一些腫瘤幹細胞，由於它們不分裂，因此在替莫唑胺處理的5天的過程中，它們僥倖「逃過」了。之後，這些原來處於靜止狀態的腫瘤細胞便開始分裂，漸漸失去了幹細胞的特性。當科學工作者們將小鼠腹腔注射IdU延長到替莫唑胺處理後的7天時，發現大多數CldU-陽性的腫瘤細胞已經不表達GFP，成為了GFP-陰性。此時的轉基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP細胞已經完全失去了幹細胞的特性，完全進入增殖狀態，使腫瘤重新開始生長。

總結這個實驗的結果就是，科學工作者們用轉基因Nestin-ΔTK-IRES-GFP標記了神經膠質瘤幹細胞，並且「跟蹤」了腫瘤內細胞的分裂情況。他們發現了一羣表達Nestin-ΔTK-IRES-GFP的細胞。這羣細胞處於靜止的未分裂的狀態，具有幹細胞的特性，因此它們不被替莫唑胺「消滅」。這些細胞正是神經膠質瘤複發之源。

那麼，科學工作者們假設，只要能消滅腫瘤中GFP-陽性的細胞，便可有效地降低腫瘤複發。為了證實這一假說，科學工作者們進行了以下的實驗。

GCV組小鼠的存活率明顯高於生理鹽水組。這說明，當GCV有效地根除Nestin-ΔTK-IRES-GFP陽性的細胞後，腫瘤的進一步發展被阻斷，小鼠的生存期明顯地延長。

聯合使用替莫唑胺和GCV以根除快速增殖中的和靜止狀態的腫瘤細胞

科學工作者們預言，如果對Mut7;Nestin-ΔTK-IRES-GFP小鼠聯合使用替莫唑胺和GCV，將最大程度地殺死腫瘤細胞。

Mut7;Nestin-ΔTK-IRES-GFP小鼠連續5天腹腔內注射替莫唑胺，在最後一次注射替莫唑胺之後兩天，皮下注射GCV。如圖。

然後科學工作者們對小鼠腦背側殘留的腫瘤進行檢測，發現聯合注射了替莫唑胺和GCV之後，GFP的表達幾乎完全消失。這說明GFP-陽性的細胞幾乎全部被根除。如圖。

而且，從圖中也可看到，注射了替莫唑胺和GCV之後的殘餘腫瘤的細胞密度跟對照相比大大地降低。這說明腫瘤體積明顯地縮小。然而，令人不解的是，雖然聯合使用替莫唑胺和GCV與使用磷酸緩衝液和單獨使用替莫唑胺相比，小鼠的生存期延長；但是聯合使用替莫唑胺和GCV與單獨使用GCV相比，並沒有延長小鼠的生存期。如圖。

科學工作者們進一步對注射了替莫唑胺/GCV的小鼠的腦進行了分析研究。發現，儘管原始腫瘤的生長被顯著抑制，但是在這些小鼠的腹側腦區產生了新的腫瘤。大部分注射了替莫唑胺/GCV的小鼠，它們的腫瘤都在腦幹區。而未處理的對照組小鼠，它們的腫瘤在背/中腦。科學家們對這一現象科學工作者們正在做進一步研究。

在這一研究中，科學工作者們用Nestin-ΔTK-IRES-GFP轉基因標記了室管膜下區神經幹細胞。非常偶然地，科學工作者發現Nestin-ΔTK-IRES-GFP轉基因同時也可標記多型性膠質母細胞瘤腫瘤細胞羣中的一個特殊的「亞羣」細胞，這個細胞亞羣具有腫瘤幹細胞的特徵。腫瘤幹細胞假說認為，腫瘤是由一羣「等級森嚴的細胞」組成的，其中只有一個「亞羣」的細胞同時保持著自我更新和分化的能力。在這個實驗模型中，只有腫瘤幹細胞有能力維持腫瘤的不斷生長，並且造成治療後的複發。這項研究確定了一種內源性膠質瘤細胞，科學工作者們假定它們就是內源性膠質瘤的幹細胞。在腫瘤細胞等級中，它們處在「頂端」位置，如圖，維持著腫瘤的不斷生長和造成化療後的複發。

在接下來的工作中，科學工作者們將進一步對這羣細胞進行分離和遺傳譜系追蹤。它們可能成為治療神經膠質瘤的新的靶標。

Reference

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