BioArt按：

CRISPR/Cas9自從2012年被發明以來，以其高效性和特異性備受各界關注，然而由於CRISPR/Cas9系統存在的脫靶風險，因此未來應用於臨床治療方面還存在一些不確定的因素。在2016年和2017年，華人科學家David R. Liu課題組先後報道了高效誘導點突變的胞嘧啶單鹼基編輯器（CBE）和腺嘌呤單鹼基編輯器（ABE），由於單鹼基基因編輯器不引入DNA斷裂，過去一段時間被認為比傳統方法更加高效而安全，能為單基因遺傳病的治療帶來了新的希望。那麼圍繞CRISPR/Cas9本身及其衍生出的單鹼基基因編輯系統來講，在應用時到底有沒有存在明顯的脫靶問題，學術界過去有過多篇文章報道，也存在一些爭議。那麼，要想解決上述問題，科學家就必須徹底顛覆原有的脫靶檢測手段，提升檢測脫靶效應的精度後再做最終判斷。3月1日，來自中科院神經科學研究所楊輝研究團隊等與中科院遺傳發育所高彩霞研究團隊在Science雜誌上以「背靠背」形式發表了兩篇研究論文，發現設計良好的CRISPR/Cas9以及單鹼基基因編輯系統ABE沒有明顯的脫靶效應。與此相反的是，BE3系統可在小鼠胚胎以及水稻中導致大量的的脫靶性單核苷酸突變出現。鑒於上述工作的重要意義，BioArt特別邀請到了來自國內外的相關權威專家（季維智、Kim Jin-Soo、李大力、李偉）進行了點評，以饗讀者！

點評丨季維智、Kim Jin-Soo、李大力、李偉

責編丨迦漵

2016年，David Liu團隊在 Nature 期刊上首次報道了基於胞嘧啶脫氨酶APOBEC1（能催化C脫氨基變成U，而U在DNA複製過程中會被識別成T）和尿嘧啶糖基化酶抑製劑UGI（能防止尿嘧啶糖基化酶將U糖基化引起鹼基切除修復）的單鹼基編輯工具（BE3）首次實現可以在不引入DNA雙鏈斷裂的情況下對單鹼基進行替換【1】，2017年該團隊在Nature上發表論文報道了另一種單鹼基基因編輯工具——腺嘌呤鹼基編輯器 (ABE)【2】，它可以將A?T鹼基對轉換成G?C鹼基對，加之2016報道的將G?C鹼基對轉換成T?A 鹼基對的成果，從此研究人員首次實現了不依賴於DNA斷裂而能夠將DNA四種鹼基A、T、G、C進行替換的單鹼基基因編輯技術（目前上述兩篇Nature論文總被引次數已超千次）。

單鹼基編輯器的開發，為定向編輯和修正基因組中的關鍵核苷酸變異提供了重要工具，由於該技術不引入DNA雙鏈斷裂，因此展現了其在遺傳疾病治療與動植物新品種培育等方面潛在的重大應用價值。然而值得注意的是，CRISPR/Cas9從問世以來，其脫靶風險一直備受關注，如果將CRISPR/Cas9及其衍生工具貿然用於臨床的話，脫靶效應可能會引起包括癌症在內的很多種副作用。儘管此前人們推出過多種檢測脫靶的方案，然而由於過去的方法或者依賴於計算機軟體預測，或者依賴於高通量測序檢測DSB產生，還有體外檢測的方法。這些方法都存在一些局限性，不能高靈敏性檢測到脫靶突變，尤其是單核苷酸突變。因此關於CRISPR/Cas9及其衍生工具的真實脫靶率一直存在爭議。那麼一種能夠突破之前限制的脫靶檢測技術，將會成為CRISPR/Cas9及其衍生工具是否能最終走上臨床的關鍵。人們迫切希望可以找到一種既能夠不依賴於脫靶位點預測，又能有足夠信噪比的精密脫靶檢測手段。

北京時間2019年3月1日凌晨，Science雜誌「背靠背」在線發表了兩篇來自中國科學家完成的研究論文，分別用不同的方法在不同的物種上首次發現了單鹼基編輯系統存在嚴重的脫靶效應，這給當前如火如荼開展的相關臨床試驗蒙上了一層陰影。

題為Cytosine base editor generates substantial off-target single nucleotide variants in mouse embryos 的研究論文由中科院神經科學研究所（中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心）、上海腦科學與類腦研究中心楊輝研究組與中科院上海營養與健康研究所隸屬的計算生物學研究所（中國科學院-馬普學會計算生物學夥伴研究所）李亦學研究組、斯坦福大學遺傳學系Lars M. Steinmetz研究組以及中國農業科學院深圳農業基因組研究所的研究人員合作完成。

該研究探索了全基因組範圍內基因編輯技術可能造成的脫靶效應，建立了一種被命名為GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）的新型脫靶檢測技術，並使用該技術發現: 近年來興起的單鹼基編輯技術有可能導致大量無法預測的脫靶，因而存在嚴重的安全風險。此研究顯著提高了基因編輯技術脫靶檢測的敏感性，並且可以在不藉助於任何脫靶位點預測技術的情況下發現之前的脫靶檢測手段無法發現的完全隨機的脫靶位點，為基因編輯工具的安全性評估帶來了突破性的新工具，有望成為新的行業檢測標準。

如果要提升檢測脫靶效應的精度，就必須徹底顛覆原有的脫靶檢測手段。首先，為了實現不藉助於脫靶位點預測，這就要求必須找到非常嚴格的對照組來確定基因突變的位點；同時為了檢測不依賴於sgRNA的隨機突變，最好使用基於單細胞全基因組測序。為了實現以上目標，楊輝研究組與合作者建立了一種名叫「GOTI」的脫靶檢測技術。研究者們在小鼠受精卵分裂到二細胞期的時候，編輯一個卵裂球，並使用紅色熒光蛋白將其標記。小鼠胚胎髮育到14.5天時，將整個小鼠胚胎消化成為單細胞，利用流式細胞分選技術基於紅色熒光蛋白，分選出基因編輯細胞和沒有基因編輯細胞，再進行全基因組測序比較兩組差異（下圖），這樣就避免了單細胞體外擴增帶來的噪音問題。而且由於實驗組和對照組來自同一枚受精卵，理論上基因背景完全一致，因此直接比對兩組細胞的基因組，其中的差異基本就可以認為是基因編輯工具造成的。

圖片來自Science論文

在楊輝實驗室全體成員與合作單位的共同努力下，GOTI系統被成功建立了起來。藉助於這個系統，團隊成員先是檢測了最經典的CRISPR/Cas9系統。結果發現，設計良好的CRISPR/Cas9並沒有明顯的脫靶效應，這個結果結束了之前對於CRISPR/Cas9脫靶率的爭議。然而團隊還檢測了另一個同樣被給予厚望的CRISPR/Cas9衍生技術單鹼基編輯系統BE3和ABE，這個系統可以精確引入點突變，在之前的研究中從未發現過有明顯的脫靶問題。在GOTI的檢測下發現，ABE系統同樣表現出非常高的特異性，然而BE3存在非常嚴重的脫靶，而且這些脫靶大多出現在傳統脫靶預測認為不太可能出現脫靶的位點，因此之前方法一直沒有發現其脫靶問題。

在BE3編輯的胚胎中，平均有283個 SNVs被檢測到，相比於Cre或CRISPR/Cas9處理組增加了20倍以上。而這些突變90%以上都呈現出G到A或者C到T的模式，進一步表明這些突變不是胚胎髮育過程中隨機產生的突變，而是由於BE3編輯所導致。這些突變隨機分布於基因組中，有許多會影響蛋白的編碼，甚至有一些位於原癌基因（Pin1）和抑癌基因（Rsu1, Stk4, Tsc1, Park7, Rbpj, Ing3, Hipk2, Phlpp2, Yeasts4, Ptch1, Stk3, Smchd1）上的突變，這意味著這些脫靶突變可能會進而引起癌症的發生，具有潛在風險，也就是說BE3系統不適合在臨床上使用。

總的來說，上述重要發現，證實了以BE3為代表的部分基因編輯技術存在無法預測的脫靶風險，讓世人重新審視了這些新興技術的風險。更重要的是，此工作建立了一種在精度、廣度和準確性上遠超越之前的基因編輯脫靶檢測技術，有望由此開發精度更高、安全性更大的新一代基因編輯工具，建立行業的新標準。

值得一提的是，上述工作曾在「基因編輯嬰兒事件中」發生後的第二天就上傳到生命科學預印本雜誌BioRxiv上（biorxiv.org/content/ear）。

據悉，該工作從實驗設計到全部完成歷時一年半左右，中科院神經所博士後左二偉（現任中國農業科學院深圳農業基因組研究所研究員）、計算生物學所博士研究生孫怡迪和魏武研究員、中國農業科學院深圳農業基因組研究所助理研究員袁堂龍為本文共同第一作者，楊輝研究員、李亦學研究員以及斯坦福大學Lars M. Steinmetz教授為本文共同通訊作者。

題為Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice的研究論文由中科院遺傳與發育研究所高彩霞研究組完成。該研究在水稻中對BE3 (基於融合rAPOBEC1胞嘧啶脫氨酶的CBE系統)、HF1- BE3（高保真版本BE3）與ABE單鹼基編輯系統的特異性進行了全基因組水平評估，首次在體內利用全基因組測序技術全面分析和比較了這三種單鹼基編輯系統在基因組水平上的脫靶效應。

該研究對經過不同單鹼基編輯系統轉化的的56棵T0代水稻植株與21株對照植株進行全基因組測序。進一步序列統計分析發現，經過單鹼基編輯系統處理後，基因組內的插入或刪除（indels）突變的數量與對照組相比沒有顯著變化，但是BE3與HF1-BE3，無論是在有無sgRNA的情況下，均可在水稻基因組中造成大量的單核苷酸變異(SNVs)，且大部分為C>T類型的鹼基突變。與經過農桿菌轉化但不含任何鹼基編輯系統的對照植株相比，BE3系統和HF1-BE3系統處理的植株在基因組範圍內的C>T SNVs分別增加了94.5%和231.9%，額外產生了98個C>T SNVs和242個C>T SNVs。重要的是，與Cas-OFFinder軟體預測結果比較發現，這些額外增加的C>T SNVs絕大多數發生在不是現有軟體可以預測到的脫靶位點。此外，這些C>T變異在染色體間均勻分布，但呈現出在轉錄活躍區富集的趨勢。這些區域傾向於釋放單鏈DNA為胞嘧啶脫氨酶提供合適的底物。研究還發現，與CBE系統相反，ABE系統表現出非常高的特異性。ABE處理的植株與對照植株在全基因組範圍內的SNV數量基本一致。

總的來說，該研究表明現有BE3和HF1-BE3系統，而非ABE系統，可在植物體內造成難以預測的脫靶突變，因此，需要進一步優化提高特異性。該工作創新性地利用相似遺傳背景的克隆植物及全基因組重測序解決了以前大量異質細胞序列分析的複雜性。

據悉，高彩霞研究組博士生靳帥、宗媛以及梁承志研究組工作人員高強為本文的共同第一作者，高彩霞研究員為本文的通訊作者。

原文鏈接：

science.sciencemag.org/

science.sciencemag.org/

參考文獻

1、 A. C. Komor, Y. B. Kim, M. S. Packer, J. A. Zuris, D. R. Liu, Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016).

2、Gaudelli, N. M., Komor, A. C., Rees, H. A., Packer, M. S., Badran, A. H., Bryson, D. I., & Liu, D. R. (2017). Programmable base editing of A? T to G? C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 551(7681), 464.

——————————————— 專家點評 —————————————————

季維智（中科院院士，昆明理工大學靈長類轉化醫學研究院院長）

CRISPR/Cas9以及Base editors等基因編輯工具在基因工程應用方面被寄予厚望，然而，脫靶效應這一爭議問題一直影響著CRISPR/Cas9系統的應用。近日，楊輝等人在Science發表題為「Cytosine base editor generates substantial off-target single nucleotide variants in mouse embryos」的文章，在全基因組水平對CRISPR/Cas9和Base editors在小鼠體內（14.5天）所產生的脫靶效應進行了系統分析，首次發現cytosine base editor 3（BE3）系統會產生較為嚴重的單核苷酸多態（SNV，single nucleotide variants）。

基於全基因組的脫靶分析，如何排除非特異背景干擾通常是影響信息學分析的一個重要因素。本項研究工作巧妙地通過對二細胞胚胎中的一個細胞進行編輯，通過熒游標記區分編輯和未編輯的細胞，從而將體內發育的個體細胞分成兩個樣本群，由於樣本來自同一遺傳背景個體，這樣就在很大程度上降低了樣本之間的非特異干擾。他們將這個方法命名為GOTI。運用該方法，本文對當前運用最為廣泛的三種基因編輯工具CRISPR-Cas9, cytosine base editor 3 （BE3, rAPOBEC1-nCas9-UGI）和adenine base editor 7.10 （ABE7.10, TadA-TadA*-nCas9）進行了深度為47X的全基因組分析。結果證明三種方法都可在小鼠胚胎中產生高效的靶向編輯。而對於脫靶效應，三種方法則大相徑庭。

在CRISPR/Cas9組中，除了極少數位於預測位點外的indels，並沒有發現其他脫靶現象。在編輯組中檢測到的SNVs數量與對照組基本保持一致，說明這些SNVs是在基因組複製的過程中自發出現的。然而，在對BE3和ABE兩組的分析中發現，BE3組樣本存在高達平均283的SNVs（有CRISPR/Cas9組20倍之多），ABE組則表現正常。在對BE3編輯組胚胎樣本的脫靶位點進一步分析發現，這些SNVs多都富集在基因編碼區，但這些脫靶效應並非來自於sgRNA的介導，很大程度上來自於過量表達的APOBEC1與DNA結合後的作用。相反，在ABE編輯組的樣本中並沒有觀察到SNVs異常的現象，文章推測這可能是由於TadA本身缺乏與DNA結合的能力導致。

base editor是目前最先進的可實現單個鹼基精準替換的基因編輯工具,編輯過程中不產生雙鏈斷裂,僅需一個 DNA 單鏈切口就能實現單鹼基精準編輯,可有效避免編輯過程中產生基因組損傷，實現高效的單個鹼基的替換編輯。本文首次在全基因組水平證實BE3系統在實現高效率的鹼基替換編輯時，會引起較為嚴重的SNVs脫靶，這對該系統的研究應用提出了挑戰。然而，對於BE的後續優化版本，如BE4或BEmax，是否也存在類似現象有待深入研究。

Kim Jin-Soo（韓國首爾國立大學化學系教授、基礎科學研究院基因編輯中心主任）

The paper is very interesting and important.We showed using Digenome-seq that cytosine base editors (CBEs) are reasonably specific in human cells, modifying fewer cites than does Cas9.Our method is limited, however, because it cannot detect sgRNA-independent mutagenic sites, if any.（這篇論文非常有意思並且其發現也有重要的意義。我們使用Digenome-seq的分析顯示，胞嘧啶單鹼基編輯（CBE）在人類細胞中是相對特異性的，比Cas9編輯的位點要少。然而，我們的方法是有局限性的，因為它不能檢測可能存在的sgRNA非依賴性的突變位點。）

The authors develop GOTI to show that CBEs can induce hundreds of unwanted, sgRNA-independent SNVs in mouse embryos.It is unclear to me whether the collateral damages are caused by the ABPOEC deaminase or the UGI moiety in CBEs.Note that CBEs are composed of ABOBEC, nCas9, and UGI (uracil glycosylase inhibitor).Adenine base editors (ABEs) lack UGI and may not cause these sgRNA-independent off-target mutations.It is now important to determine which component is responsible for the collateral mutations and how to reduce or avoid them.（文章的作者們開發了GOTI的方法，並且研究表明CBE可在小鼠胚胎中誘導數百個不需要的sgRNA非依賴型的SNV。我還不是很清楚這些附帶損害是由ABPOEC脫氨酶還是CBE中的UGI引起的。值得注意的是CBE是由ABOBEC，nCas9和UGI（尿嘧啶糖基化酶抑製劑）組成。腺嘌呤單鹼基編輯（ABEs）不含UGI，也可能因此不會導致這些sgRNA非依賴性脫靶突變。現在重要的是確定哪個組成部分造成了這些突變以及如何減少或避免它們。）

李大力（華東師範大學生命科學學院教授）

單鹼基編輯工具CBE、ABE自誕生以來就備受基因編輯領域的關注。一方面因為它們不需要產生雙鏈DNA斷裂（DSB）就能夠進行鹼基突變，從這一點上講它們可能比CRISPR/Cas9系統更為安全。而另一方面也是因為至今還沒有一個很好的方法從全基因組的角度來研究單鹼基編輯系統在體內產生的脫靶情況。由於生物體和細胞系在生長或增值過程中可能累計大量的自發突變，這些突變以單核苷酸的異質性（SNV）為主，所以很難區分哪些突變是自發產生而哪些是由於CBE、ABE進入細胞後造成的脫靶突變。

近日，中科院神經所楊輝課題組與遺傳發育研究所的高彩霞課題組，各自運用自己擅長的學科方法，克服了單鹼基編輯工具脫靶檢測的問題。楊輝課題組巧妙地運用了2細胞胚胎顯微注射解決了這一問題。由於2細胞期胚胎中2個細胞的基因組背景幾乎相同，所以保證了基因編輯工具剛進入其中一個分裂球時，這兩個細胞的基因組幾乎不會有本底水平的SNV差異。而高彩霞課題組則很好地運用了轉染從同一克隆而來的水稻愈傷細胞形成植株來解決本底SNV的問題。

兩個團隊在不同系統中的研究結果十分吻合。ABE組內的SNV與對照組的SNV相近，這些SNV很可能是細胞增殖時自發產生的突變，可見ABE工具的特異性較高。與之截然相反的是，兩組人員都在BE3實驗組檢測到了顯著高於對照組的SNV數量，在楊輝組的實驗結果中兩者之間的差異達到了20倍。這些SNV類型基本都是C/G>T/A的突變，更重要的是BE3的脫靶似乎與Cas9的特異性關係不大。在楊輝的實驗組中，只加入Cas9/sgRNA的實驗組並不會引起全基因組範圍內SNV的上升，這一點也駁斥了之前關於Cas9在小鼠體內造成嚴重大範圍基因突變的報道。而在高老師的實驗組中，不加入sgRNA，或者使用高保真型Cas9（HF1-BE3）BE3都能夠引發全基因組範圍的C/G>T/A脫靶現象。似乎BE3的脫靶只與rAPOBEC的活性有關。

由於之前檢測BE3脫靶主要靠預測sgRNA脫靶位點或者體外Digenome-seq，並未發現BE3的嚴重脫靶現象。所以高彩霞與楊輝實驗組的研究結果能夠讓領域內的研究人員重新評估BE3的特異性，並及時推動更為精確的CBE系統的開發（目前還不知道，YEE-BE3與eA3A-BE3在體內的脫靶情況）以及相關脫靶檢測方法的改進，這對於單鹼基編輯工具乃至整個基因編輯領域都具有十分重要的意義。

許凱、李偉（中國科學院動物研究所）

以CRISPR工具為代表的基因編輯技術以其簡單、快速、高效等優點給生物學、農業和醫學研究及應用帶來了革命性的變化。然而基因編輯的應用仍然面臨諸多挑戰，其中潛在的脫靶效應是限制其應用的一個主要問題。

鹼基編輯技術是基因編輯技術的一個重要衍生技術。它能夠不依賴DNA雙鏈斷裂（DSB），在目標基因座上直接不可逆地將一個鹼基對轉換為另一個鹼基對，從而大幅降低雙鏈斷裂修復所導致的隨機插入、缺失或易位等基因組突變。由於單鹼基突變是自然界突變的主要形式之一，尤其是人類基因組致病突變的主要形式，鹼基編輯技術在基因治療等應用中具有重要前景。但是鹼基編輯技術的脫靶效應仍然有待全面的檢測。

科學家們已經開發出多種在體外或者細胞水平進行的脫靶效應檢測方法【1-3】，在個體水平全基因組範圍內的脫靶效應檢測技術和方法近期也迅速發展。例如2018年Bradley等人報道CRISPR-Cas9會產生大片段缺失和複雜的染色體重排【4】；Joung等人報道了利用CRISPR–Cas9在小鼠體內全基因組範圍進行脫靶效應的檢測和評估。但是針對單鹼基突變的脫靶效應評估需要排除遺傳背景、個體差異和基因複製隨機突變等因素，因此常規脫靶效應評估方法往往無法有效評估。例如2017年一篇文章報道了CRISPR-Cas9基因編輯技術在小鼠體內可引發數百個位點突變，但是由於小鼠遺傳背景和未設置好對照組等原因，導致結果受到大量質疑最終文章撤稿。針對鹼基編輯技術的脫靶效應檢測， Kim和Songyang等人曾分別進行全基因組範圍內的脫靶效應的評估，發現胞嘧啶鹼基編輯器（CBE）具有很高的特異性【5】；而腺嘌呤鹼基編輯器（ABE）也非常特異，只有很少的脫靶效應【6】。然而更加可靠的的檢測單鹼基突變的方法仍然有待發展。

在本期Science發表的來自楊輝/李亦學/ Steinmetz和高彩霞研究團隊的兩篇文章針對鹼基編輯技術可能的脫靶效應進行了全基因組系統評估，並發現了胞嘧啶鹼基編輯器（CBE）會引發大量非特異脫靶突變而腺嘌呤鹼基編輯器（ABE）具有較高特異性這一重要現象。楊輝/李亦學/ Steinmetz團隊開發了GOTI技術方法，通過在小鼠的2細胞胚胎的一個卵裂球中注射鹼基編輯等基因編輯工具和Cre介導的譜系標記，把來自同一個個體的進行和未進行鹼基編輯的細胞進行有效區分，同時通過同一受精卵來源有效避免了個體差異等因素導致的單核苷酸變異干擾。

他們發現CRISPR-Cas9和ABE系統在編輯細胞中產生的插入缺失突變（Indels）和單核苷酸突變（SNV）非常少，和軟體預測的脫靶位點並沒有重疊，與未編輯細胞中產生的突變沒有明顯差異，說明這些突變可能是由自發突變產生的。然而CBE系統產生的SNV比對照組高20倍，並且這些SNV主要是C>T和G>A突變，而且CBE產生的這些SNV突變與軟體預測的脫靶位點並沒有重疊，是不依賴於sgRNA序列的。這些結果表明CBE系統則會產生大量的脫靶導致的單核苷酸突變。這項工作通過GOTI方法排除了由於小鼠遺傳背景和個體差異而產生的單核苷酸變異，證明CRISPR-Cas9和ABE系統具有很高的保真性，而CBE則會產生脫靶突變。

在高彩霞研究員團隊進行的一項獨立研究中，他/她們利用全基因組測序對CBE、CBE-HF1和ABE處理過的水稻植株進行了全基因組範圍內的脫靶突變的檢測，發現CBE系統會明顯地產生脫靶單核苷酸突變，而ABE系統則具有很好的保真性。這項工作首次在植物體內（in vivo）全基因組範圍內評估了CBE和ABE鹼基編輯系統的脫靶效應，為提高鹼基編輯工具的特異性指明了方向。

這兩項工作相互印證，利用不同的模式生物體系很好的證明了CBE鹼基編輯工具存在較為嚴重的脫靶風險。同時基於這兩項工作，為什麼CBE鹼基編輯會比ABE鹼基編輯具有更高的脫靶效應、以及這些脫靶效應會在個體水平產生哪些功能改變等問題仍然有待進一步探索。這兩項工作的重要發現告訴我們在利用鹼基編輯工具開展相關應用尤其是臨床應用之前，審慎地開展脫靶效應等安全性評估非常重要，否則CBE鹼基編輯存在的嚴重脫靶效應可能導致重大安全性問題。同時這兩項工作也充分說明繼續開發安全高效的基因編輯工具仍然是該領域存在的重大需求。

參考文獻：

1. Tsai, S.Q., et al., GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol, 2015. 33(2): p. 187-197.

2. Kim, D., et al., Genome-wide target specificities of CRISPR-Cas9 nucleases revealed by multiplex Digenome-seq. Genome Res, 2016. 26(3): p. 406-15.

3. Tsai, S.Q., et al., CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets. Nat Methods, 2017. 14(6): p. 607-614.

4. Kosicki, M., K. Tomberg, and A. Bradley, Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol, 2018. 36(8): p. 765-771.

5. Kim, D., et al., Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases.Nat Biotechnol, 2017. 35(5): p. 475-480.

6. Liang, P., et al., Genome-wide profiling of adenine base editor specificity by EndoV-seq. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 67.

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