crispr系統要實現精確打靶需要一個grna把cas9蛋白引導到特定的基因位置進行切割。

如果使用張峰老師的網站設計grna的話,一般就返還一個20nt長的grna,再加上一段ngg的pam序列,你可以理解為決定這次切割精確性的序列總長也就23nt。

在整個基因組中,其實很容易找到很多與你設計的這23nt序列就相差一兩個鹼基的序列,而這種序列往往就處在其他基因或者非編碼序列里。這個你設計grna的時候一般會有一個可能脫靶位點的報告,基本上都是只差不到4個鹼基的序列。這樣的話,這些相似度很高序列就很可能也被你設計的grna切開。

當然,上述情況還只是默認四個核苷酸均勻分布在整個基因組上的情況。要知道,基因組裡面有很多相似度非常高的基因,針對這些基因,操作難度就更大了。

針對這些可能脫靶的情況,也有一些對cas9的改進型,例如dual cas9(可能是這個名字,純手打,記錯了不負責任哈),每條grna引導的cas9隻能切開單鏈dna,需要兩條grna一起到達指定位置完成切割才能完成基因組的斷裂。這樣理論上可以減少脫靶發生。


博主你好!

Crispr/cas9的是目前應用最廣泛的也是效率最高的第三代基因編輯技術。

優點是可以定向的查找並裁剪某段序列,刪除該片段;缺點就是由於他是比較新的基因編輯技術,所以他的實驗研究基礎較弱,存在不穩定性。

當然他的缺點是一步步慢慢的被攻克的。

脫靶的問題,這裡需要詳細和你講解的就是cas9蛋白若和目的基因病毒在一個載體上的話脫靶率是很高的。我們實驗室目前均採用的是雙載體,先由cas9蛋白的載體篩選完後,再上目的基因載體的病毒,這樣的效果會更好一些。

希望可以幫助到你,謝謝。


脫靶的產生是因為gRNA識別錯了的鹼基序列。容易脫靶應該是設計的gRNA不好,打靶到了別的同源區。其實在gRNA設計階段就可以很大一部分的脫靶可能性。再配以後期陽性克隆的高危位點測序脫靶分析,可以將CRISPR的脫靶效應控制的很好。


謝邀,不過我真不懂


因為就算sgRNA和靶基因不是完全匹配,也有可能結合上去,招募cas9過去把靶基因切斷,利用修復機制使該基因發生如移碼等突變,最後使非靶基因沉默,產生脫靶。

另外,sgRNA是很短的,20-30nt,極有可能以完全配對的形式結合到與靶基因相似的其他基因上,產生脫靶。

題外話,由於脫靶效應未得到完美解決所以這項技術還只能停留在實驗階段,並不能進行醫療等人體實驗,因為如產生脫靶,可能把一些生命活動相關的基因敲除,產生可怕的後果!


因為你把這一問題的答案寄希望於知乎而非自己。

而知乎里魚龍混雜,說不定有大神就給你認真回答了。但大部分情況是邀請的都是我這種不相關人士。

最後,瀉藥。但能不能以後生物方面的不要邀我了,最後廁所和飼料方面也不要邀我了。。。


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