干干干干货！ DNA提取常用试剂及操作方法

真核细胞DNA的制备与定量

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。

这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：

（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；

（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

1试剂准备

1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。

2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。

3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4．20% SDS

5．2mg/ml蛋白酶K

6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7．无水乙醇、75%乙醇

2操作步骤

（一）材料处理

1．新鲜或冰冻组织处理：

⑴ 取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。

⑵ 将匀浆液转移到1.5ml离心管中。

⑶ 加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混匀。

⑷ 60°C水浴1-3hr。

2．培养细胞处理：

⑴ 将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。

⑵ 离心4000g×5min，去除上清液。

⑶ 加10倍体积的裂解缓冲液。

⑷ 50-55°C水浴1-2hr。

（二）DNA提取

1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。

2. 离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。

3. 加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

4. 加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5. 加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。

7. 待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。

8. 沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min ，弃上清液。

9. 室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜。

（三）DNA定量和电泳检测

1.DNA定量：

DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。

DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。

2.电泳检测：

取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的完整性，或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。

3注意事项

1. 所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。

2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。

3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性

4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的。如要求更高，可进行DNA纯化。

质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随著染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。

对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

1试剂准备

1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。

2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。

3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。

4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）

6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）

7. 5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

8．溴化乙锭（EB）：10mg/ml

9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。

10. 6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。

11. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。

2操作步骤

1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。

2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。

5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。

6.加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g × 10min。

7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min。

8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。

9.沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。

3质粒DNA的电泳检测

观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。