Immunity：发现一群新的肝巨噬细胞
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说起肝内定居型巨噬细胞，我们就想到了Kupffer细胞，那么在正常情况下肝脏是否只有Kupffer细胞一种定居型巨噬细胞呢？
悉尼大学皇家爱尔弗雷德王子医院的Sierro等发现了一群定居在肝包膜下的巨噬细胞（LCM），不同于Kupffer细胞来源于胚胎卵黄囊，LCM来源于血单核细胞。文章发表于2017年8月《Immunity》上，今天荷叶和大家分享此篇论文。
文章解析
鉴定一群新的细胞可以从以下几个方面著手：1）细胞群的特征，2）起源，3）功能。荷叶从这几方面分析该文章。
第一步，细胞群的特征
细胞群的特征可以分两个方面，①细胞表面有什么特异的标志，②细胞的表达谱是否特异。
作者利用了多光子体内成像（2PM）对体内活细胞进行表面标志的染色，发现肝包膜处的巨噬细胞与Kupffer相比，其伪足（树突）更多更长。与Kupffer一样，CD45+MHCII+F4/80+，但是特异的是：Tim4-CX3CR1+。
为了避免荧光抗体对巨噬细胞的激活，作者采用了多种荧光报告小鼠，结果显示，与Kupffer细胞相比肝包膜处的巨噬细胞特异的表达CD207（Langerin）。
FACS染色进一步确认了体内细胞染色的结果。
同时，肝脏切片荧光染色结果显示CD207是肝包膜下巨噬细胞较特异的标志。
白色虚线为肝包膜
进一步，作者采用目前最先进的细胞分群仪器——质谱流式分析仪，对肝内髓系细胞进行精确分群。结果发现肝包膜巨噬细胞LCM呈CD207+(GFP+)，同时表达CD64+F4/80+Tim4-CX3CR1+（Kupffer细胞Tim4+CX3CR1-）。
以上是通过表面标志对肝包膜下细胞进行分群，那么这群细胞确实是一群独立的肝巨噬细胞吗？为了回答这个问题，作者对这群细胞进行了表达谱的分析，通过生物信息学分析，发现这群细胞表达巨噬细胞相关的核心基因，如Fcgr1，Mafb等，PCA分析显示LCM与Kupffer差异较大，但与皮肤巨噬细胞、肠巨噬细胞接近。
这样我们就能得到肝包膜下巨噬细胞LCM的基本特征，如下图所示：
第二步，LCM来源于什么细胞？
作者首先进行了骨髓移植实验和肝移植实验，发现骨髓细胞能够补充肝脏的LCM。
其次，作者进行了小鼠的联体实验，进一步确认LCM来源于骨髓细胞。同时作者还发现CCR2缺陷骨髓细胞不能补充、更新LCM。
那么是骨髓中的哪群细胞补充LCM呢？通过单核细胞/腹腔巨噬细胞移植实验，发现血中单核细胞能分化成LCM。当以抗生素处理小鼠降低血中单核细胞数目时，LCM的数目同时降低。
深入研究发现，LCM的补充更新依赖CSF-1/CSF-1R信号。肝包膜区域高表达CSF-1，以抗体封闭CSF-1或CSF-1R能显著降低小鼠LCM的数目。
通过上述结果我们得到结论：LCM来源于血单核细胞，并且依赖于CSF-1/CSF-1R信号。
第三步，LCM的功能是什么？
研究发现LCM与肝包膜胶原纤维相邻，具有长的突起（伪足），其一端伸出肝包膜，一端深入肝血窦，并且LCM伪足在不停的运动。
LCM的这种形态结构提示其可能具有感应周围环境的作用，特别是肝包膜外环境。通过腹腔注射BCG模拟腹腔感染，发现LCM能向BCG延伸。同时LCM募集大量的中性粒细胞（Neu），Neu吞噬进入肝脏的BCG。
当以抗CSF-1R抗体降低LCM的数量时，在存在腹腔感染时Neu向肝包膜的募集显著减少，提示Neu的募集确实依赖于LCM（分泌的某些趋化因子或细胞因子等）。
综上所述，本篇文章鉴定了肝内的一群不同于Kupffer细胞的巨噬细胞——肝包膜下巨噬细胞LCM，它们就像边疆的边防战士一样守卫肝脏的周边环境，当来自于腹腔微生物侵袭肝包膜时，LCM及时发出信号，招募大量Neu吞噬、消灭微生物，维持肝脏微环境的稳态。
荷叶点评
1、文章的矛盾之处：
1）Itgax又称为CD11c，那么为什么在体内细胞成像和FACS检测时肝实质巨噬细胞不表达CD11c，LCM低表达CD11c，而在Itgax-YFP小鼠中肝巨噬细胞和LCM又是YFP强阳性呢（红圈圈出），是荧光强度的问题吗？用Itgax-YFP做骨髓移植、肝移植实验是否合适？
2）联体实验时发现CCR2敲除小鼠骨髓细胞不能补充更新LCM，但是作者又发现CCR2敲除小鼠LCM数目与对照相比无差异（红圈圈出），前后是否有矛盾？
2、研究LCM起源比较权威的方法还有系谱示踪，如果加上这个就更有说服力。
3、LCM分泌的什么细胞因子募集Neu？荷叶认为可以补充相关实验。
4、文章主要研究静息状态下和一些细菌感染时LCM的变化，下步可以深入研究其他疾病状态下LCM的变化，比如肿瘤腹腔转移或肝硬化时LCM会如何呢？
5、荷叶读过不少细胞免疫方面的文章，感觉这类文章常常需要用到很多品系的小鼠，如本文用到了17种转基因或基因敲除小鼠。此外本文还用到了先进的质谱流式分析仪（金属标记抗体，可以有上百个通道）、多光子成像（体内活细胞标记），这些都不是一般实验室能完成的，所以荷叶觉得很多时候实验平台很重要！
参考文献：
Sierro F, Evrard M, Rizzetto S, Melino M, Mitchell AJ, Florido M, Beattie L, Walters SB, Tay SS, Lu B, Holz LE, Roediger B, Wong YC, Warren A, Ritchie W, McGuffog C, Weninger W, Le Couteur DG, Ginhoux F, Britton WJ, Heath WR, Saunders BM, McCaughan GW, Luciani F, MacDonald KPA, Ng LG, Bowen DG, Bertolino P.A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment.Immunity. 2017 Aug 15;47(2):374-388.e6. doi: 10.1016/j.immuni.2017.07.018.
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