2、泵的使用和维护注意事项

为了延长泵的使用寿命和保持其输液的稳定性，必须按照以下的注意事项进行操作

• 防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其他任何杂质微粒都会磨损柱塞，密封环，缸体和单向阀，因此应该预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是过滤，可以采用Millipore滤膜（0.2μm或者0.45μm）等滤器。泵的入口都应该连接砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应该经常清洗或者更换。
• 流动相不应该含有任何腐蚀性的物质，含有缓冲液的流动相不应该保留在泵内，尤其是在停泵过液或者更长时间的情况下。如果将含有缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或者泄露，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。
• 泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。
• 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。
• 流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。

如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应措施排除故障：

1. 没有流出相流出，又没有压力指示。原因可能是泵内有大量气体，这是可打开泄压阀，使泵在较大流量（如5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个50ml针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损，需更换。
2. 压力和流量不稳。原因可能是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，侵入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，课卸下砂滤棒侵入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒侵入稀酸（如4mol/L硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。
3. 压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。压力过低的原因则可能是管道有泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段进行。

第三部分：进样器

在早期，一般使用隔膜和停流进样器，装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。HPLC进样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。

六通阀使用和维护注意事项

• 样品溶液进样前必须用0.45μm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。
• 转动阀芯时不能太慢，更不能停流在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样为时，过高的压力将使柱头损坏。
• 为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用溶解样品的溶剂冲洗，再用水清洗。

第四部分：色谱柱

色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。

柱的使用和维护注意事项

• 避免压力和温度的急剧变化及任何机械振动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充情况；柱压的突然升高或降低也会松动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。
• 应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应该直接从有机溶剂改变为全都是水，反之亦然。
• 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
• 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶「饱和」，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
• 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护住一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。
• 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应该是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50-75ml。

阳离子交换柱可用稀酸缓冲液清洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醛、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次清洗。

• 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲液留在柱内精致过夜或更长时间。
• 色谱柱使用过程中，如果压力过高，一种可能性是烧结滤片被堵塞，这是应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现坍塌，死体积增大。

后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小缸将柱头填料取出1-2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。

柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（5-30mm），可以起到保护，延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一部分柱效，这是值得的。

通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH 2-9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更容易吸附在柱顶的填料上。新的色谱柱在使用一段时间后，柱顶填料可能坍塌，使柱效下降，这时也可以补加填料使柱效恢复。

每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醛冲洗至基线平衡。当采用盐酸缓冲溶液做流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族（氟、氯、溴）化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。

第五部分：检测器

检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱剂中组分的量转变为电信号。HPLC的检测器要求灵敏度高、杂讯低（即对温度、流量等外界变化不敏感）、线性范围宽、重复性好和适用范围广。

与检测器有关的故障及其排除

• 流动池内有气泡

如果有气泡连续不断的通过流动池，将使杂讯增大，如果气泡较大，则会在基线上出现许多线状「峰」，这是由于系统内有气泡，需要对流动相进行充分的除气，检查整个色谱系统是否漏气，再加大流量祛除系统内的气泡。如果气泡停流在流动池内，也可能使杂讯增大，可采用突然增大流量的办法除去气泡（最好不连接色谱柱）；或者启动输液泵的同时，用手指紧压流动池出口，使池内增压，然后放开。可反复操作数次，但要注意不使压力增加太多，以免流动池破裂。

• 流动池被污染

无论参比池还是样品池被污染了，都有可能产生噪音或者造成基线漂移。可以使用适当溶剂清晰检测池，要注意溶剂的互溶性；如果污染严重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鲜溶剂冲洗，或者取出池体进行清洗，更换窗口。

• 光源灯出现故障

紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作时，可能产生严重噪音，基线漂移，出现平头峰等异常峰，甚至使基线不有回零。这时需要更换光源灯。

• 倒峰

倒峰的出现可能是检测器的极性接反了，改正后即可变成正峰。用示差折光检测器时，如果组分的折光指数低于流动项的折光指数，也会出现倒峰，这就需要选择合适的流动相。如果流动相中含有紫外吸收的杂质，使用紫外检测器时，无吸收的组分就会产生倒峰，因此必须用高纯度的溶剂做流动相。