完整透明大腦三維成像你見過嗎？——解鎖CLARITY組織清理新技能！
作者：光哥哥（EffieLiu） 紐約州立大學石溪分校神經生物學
劃重點：今天給大家介紹一個叫做CLARITY（Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/In situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel）的技術/方法。CLARITY是一種使組織透明化的清理技術，它通過水凝膠固定完整的組織，在保存完整的組織框架結構的情況下，原位保留蛋白質和核酸，剔除其他組織成分如脂質，讓大腦變得「透明」進而實現三維成像。這項技術可以使我們探究大腦功能時能更接近真實情況，特別是有助於我們理解神經系統中的互相聯繫。此外，該項技術在2013年曾入選Science雜誌的「十大突破」之一，評語是，「此技術改變了研究者看待和研究大腦這個錯綜複雜器官的方式！」
先讓大家觀賞關於這項技術的官方視頻（現在都是流量不限量啦，各位也不需要在wifi下才能觀看咯）：
視頻來源https://www.nature.com/news/see-through-brains-clarify-connections-1.12768
與常見的黑白CT, MRI圖，以及稍微有那麼一點顏色的免疫組化圖相比，這些色彩鮮艷的3D高清大圖肯定讓你眼前一亮吧！他們怎樣拍出完整大腦的三維視頻呢？接下來我們就來一步步揭開它的炫彩面紗！
1.傳統大腦切片成像的局限
為了研究突觸、神經元及神經環路等大腦組織，我們通常需要對大腦組織進行切片、染色、成像。但其實大腦中有千千萬萬個神經元和突觸，各個神經細胞之間也有著千絲萬縷的聯繫，而它們的聯繫是三維的。單純對大腦組織進行縱軸或者橫軸方向的切片，難免讓我們忽略切片以外的相互聯繫。特別在研究大腦功能與結構關係的方面，能夠在完整的大腦結構上展開實驗是十分有必要且迫切需要的。但是，為什麼我們不能對整個大腦進行染色，然後直接通過激光共聚焦顯微鏡或者其他熒光顯微鏡進行檢測呢？
2.完整組織3D成像的難關
首先，我們來看看對大腦整體進行成像面臨的幾個技術問題：
（1） 穿透力（Penetration） 整個大腦是實心的，如果對整個大腦進行成像，需要顯微鏡發射出很強的光源。但光強度越大，被免疫染色的物質越容易發生熒光猝滅，導致最後的成像效果不理想。而且，現有的激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）也只能到達大腦表面以下約150μm的深度；即使是穿透力較高的雙光子激發熒光顯微鏡（TPEFM） 也不能超過大腦表面以下500μm的深度。
（2）光散射（Light scatter） 由於細胞膜是由脂質雙分子層組成的，且大腦中也還有很多的脂質，這些脂質能將光散射，從而削弱光強度。這又回到了第一個技術問題——即穿透力太弱的問題。
3.完整組織3D成像的突破口
在弄清楚面臨的問題以後，CLARITY研發團隊就要「搞事情」啦！畢竟人家是一個嚴謹的科研團隊，「搞事情」之前人家還制定了幾個「小目標」：
（1）可以迅速將完整的組織變為透明，同時大分子能夠穿透（即提高光穿透性並減少光散射）；
（2）同時保持組織的完整性（即不能擾亂整個框架結構）。
隨後，CLARITY研發團隊針對在保持結構完整性的情況下「如何提高穿透力」和「如何減少光散射」這兩個主要問題進行了探索。
之前小編也提到了，脂質雙分子層是使得光散射發生的「罪魁禍首」，它會讓分子探針和光子難以進入組織內部，削弱了光的穿透力。因此，如果能在不損害其他物質的情況下剔除脂質雙分子層，光和大分子便可能穿透進入組織內部，進行完整組織的3D成像和免疫組化熒光分析。
4.CLARITY技術——重點之獲得3D完整組織
但是，怎樣才能保持組織的完整性呢？保持組織完整性——也就是CLARITY技術的重點。接下來我們就來正式解鎖CLARITY（製作大腦3D炫彩高清大圖）的新技能啦！
CLARITY技術大致包括以下幾個步驟：
Step1: 水凝膠單體融合
Step2: 水凝膠——組織雜交
Step3: 電泳——剔除脂質
Step4: 全組織免疫染色
Step5: 全組織成像
（水凝膠：水凝膠是化學或物理交聯而成的具有三維網路結構的高分子材料，其高分子網路中含有大量的水並能保持一定的形狀。）
小編個人認為，CLARITY技術的巧妙之處在於其用水凝膠的方法原位固定了整個組織，然後用電泳除去脂質。在組織固定時加入了甲醛，並且還加入了水凝膠單體（丙烯醯胺）。甲醛是很好且常用的組織固定劑，其有效固定作用的要點是，在蛋白質末端基團之間形成交聯鏈，保持細胞、組織的固有形態和結構。而同時加入甲醛和水凝膠單體，甲醛不僅與組織發生交聯，還作為橋樑把水凝膠單體與組織中的生物分子（如蛋白質、核酸及小分子）連接了起來。然後水凝膠單體在溫度升高的驅動下聚合交聯形成具有三維網路結構緻密水凝膠。此時形成的水凝膠—組織交聯體就能夠支持和固定組織的整體結構。此外，由於脂質和其他生物分子缺少與甲醛和水凝膠單體相互作用的功能基團，它們遊離於水凝膠—組織交聯體之外。所以通過加入SDS（十二烷基硫酸鈉，一種表面活性劑）使得脂質形成帶負電荷的膠束（圖1. Step3），然後進行電泳，帶負電荷的膠束便向正極移動，富集，最後除去。這樣我們就能得到僅含有蛋白質和核酸的完整大腦結構了。
圖2為小鼠大腦經CLARITY技術處理前後的對比圖。很明顯，在經過CLARITY技術處理的大腦組織變得非常透明。
獲得透明的組織以後，根據實驗需要對其進行相應蛋白的染色，抗體洗脫，成像（圖3）。圖3從不同視角顯現出經CLARITY處理後的小鼠大腦染色均勻且成像清晰。較為成功地解決了文章開頭提到的兩個技術問題：如何提高光穿透力和減少光散射。
圖5是成年斑馬魚大腦經過CLARITY技術處理（水凝膠雜交，脂質清除），抗酪氨酸羥化酶抗體（anti-tyrosine hydroxylase, TH）和Alexa Fluor 594染料分別作為一抗和二抗免疫染色後，在25x水浸物鏡（water immersion objective）下獲得的圖像。
至於三維圖像和視頻是通過怎樣設置和調節參數獲得呢？說來慚愧，這已經超出小編的知識範圍。希望下次有機會小編我「學成歸來」再與大家一同探討顯微鏡方面的知識啦！ 文末也附上了參考文獻，各位同仁感興趣的話可以一探究竟。
在CLARITY問世之後，不少科研團隊也紛紛加入此行列，有的對CLARITY技術進行優化，也有開發出其他組織清理技術的，如SeeDB，ClearT2，CUBIC，iDISCO，vDISCO等。這些技術與CLARITY技術相比，主要在使組織透明化的試劑，免疫標記以及成像用的顯微鏡方面有所不同。與CLARITY技術相同，這些技術主要目標還是儘可能讓組織透明化，提高免疫熒光解析度，讓成像更加清晰。
總之這些技術上的突破讓我們的科學探索更加貼近真實。尤其是在神經科學領域，我們可以通過基因靶向或基因標記的方法來揭示某些基因在投射形成過程中調節軸突導向的作用；研究神經退行性疾病在基因表達、細胞凋亡狀況等方面對全腦的影響；以及研究大腦中連接組學的問題等。隨著組織處理和成像技術的不斷進步，我們也會逐漸深入大腦，揭開它的神秘面紗，為腦部疾病帶來新的、有效的治療方法！
【參考文獻】
1. Chung K, Wallace J, Kim SY, et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems.[J]. Nature, 2013, 497(7449):332-337.
2. Renier N, Wu Z, Simon D J, et al. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging.[J]. Cell, 2014, 159(4):896-910.
3. Ke MT, Fujimoto S, Imai T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction[J]. Nature Neuroscience, 2013, 16(8):1154.
4. Hama H, Kurokawa H, Kawano H, et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain[J]. Nature Neuroscience, 2011, 14(11):1481.
5. https://www.nature.com/news/see-through-brains-clarify-connections-1.12768
歡迎大家閱讀往期文章
知乎用戶
也歡迎大家關注我們的其他平台：
微信公眾號：腦人言（ibrain-talk）
新浪微博：腦人言
推薦閱讀：
