研究表明NSCLC的腫瘤組織中存在基因突變的異質性，即一個腫瘤中部分細胞為EGFR突變型，部分為EGFR野生型。2011年JCO雜誌報道顯示，腫瘤中EGFR突變的量可預測EGFR TKI療效，EGFR突變數高的患者比EGFR突變率低的患者和EGFR野生型的患者更能從EGFR-TKI的治療中獲益。另一篇關於腫瘤突變異質性的文章2012年發表在PLOS ONE雜誌上，將45例EGFR突變型患者的腫瘤組織經顯微切割成1431個組織塊，對這些組織塊分別進行EGFR突變檢測，其中21例（47%）患者的腫瘤組織為純的EGFR突變型，24例（53%）的患者腫瘤組織中存在突變的異質性（即部分組織塊為EGFR野生型）。同樣的40例EGFR野生型的患者的腫瘤組織也進行了相似的檢測，其中36例（90%）患者的腫瘤組織為純的EGFR野生型，4例患者（10%）存在突變的異質性（即部分組織塊中檢測到EGFR突變）。該研究通過DHPLC及ARMS兩種方法檢測EGFR複合突變的發生率分別為32.9%和28.2%，再次說明腫瘤異質性的存在。2012年發表在Cell雜誌上的一篇文章解釋了腫瘤異質性產生的原因：如果一個腫瘤的所有細胞均來自同一個克隆，則EGFR突變狀態單一；而如果一個腫瘤由來自不同克隆的細胞組成，不同克隆間EGFR突變狀態不同，就可能導致腫瘤異質性的產生。

EGFR-TKI耐葯機制你瞭解嗎？

EGFR-TKI藥物是目前治療EGFR突變型非小細胞肺癌指南推薦的一線標準，但EGFR敏感突變的患者選擇EGFR-TKI治療仍有30%原發耐葯，且大多患者治療8-14個月左右會出現繼發耐葯。如何深入理解耐葯機制，選擇合適的治療手段是臨牀醫生需面對的問題。 1976年，Nowell[1]在《Science》發表文章提出「腫瘤細胞進化」的概念。腫瘤通常起源於一個正常細胞的惡變。這個癌變的細胞由於基因組的不穩定性和腫瘤微環境的作用在傳代過程中會不斷進化，即不斷有新的基因突變產生。這是同一瘤體內異質性產生的根源。2012年，Timothy[2]等把瘤內異質性比喻為一棵不斷生長的樹。「樹榦」由佔主導地位的驅動基因突變構成，其遺傳信息存在於每個腫瘤細胞中，定義靶向治療藥物的敏感性和原發耐葯；不同「樹枝」間的基因突變譜不同，即同一瘤體內存在不同亞羣，決定靶向藥物的繼發耐葯機制由於腫瘤異質性的存在，在使用激酶抑製劑類的靶向藥物後，部分癌細胞會發生通路的再激活，就導致耐葯。如果再激活的通路由靶激酶的突變引起，可使用針對該靶點的新一代藥物，或者聯合用藥；如果再激活由旁路機制引起，可選擇聯合旁路抑制的靶向藥物。 在EGFR敏感突變但是對TKI原發耐葯的患者中，人們發現，除了EGFR敏感突變，還可能存在其他EGFR突變或通路異常。包括：1、同時存在T790M突變[3]；2、抑癌基因PTEN的缺失或PIK3CA突變導致PI3K/AKT通路的異常激活[4,5]；3、與IGF1R 通路的crosstalk[6]；4、NFκB通路的激活[7]；5、促凋亡蛋白BIM基因多態性的缺失[8]。

上述與EGFR敏感突變同時存在的突變或通路異常導致腫瘤對TKI的敏感性下降。而且，這些異常是腫瘤細胞進化過程中的早期基因改變，即「樹榦」的遺傳學信息。

EGFR-TKI的繼發耐葯機制目前認為主要分為3大類：1、EGFR第二位點T790M突變；2、旁路激活；3、表型轉化。此外，仍有15%-20%的耐葯機制不明。大約50%-60%的EGFR-TKI繼發耐葯是EGFR T790M突變導致。T790M突變所致的蛋白質空間結構異常使第一代TKI不能很好的結合到EGFR酪氨酸激酶區，阻止了TKI發揮抑制EGFR通路的作用；此外，T790M突變增加了EGFR酪氨酸激酶與ATP的親和力因此T790M突變導致了對第一代EGFR-TKI的耐葯。2016年， Aaron[9]等發現，T790M突變既可能是原本就存在於瘤體內的亞羣，對TKI敏感的細胞凋亡後被篩選出來的，也可能是使用TKI後由於腫瘤細胞進化新出現的突變。EGFR旁路的激活包括MET、HER2擴增，PIK3CA突變、BRAF突變等， 整體約佔TKI獲得性耐葯機制的20%。表型轉化包括向小細胞肺癌轉化和上皮-間質轉化（EMT），這部分分別佔10%和2%左右，有研究認為，RB1和TGF-β分別介導了上述表型轉化。雖然對EGFR-TKI的臨牀應用和耐葯機制的研究近10年取得了長足進步，但仍有15%-20%第一代TKI的耐葯機制不明，對耐葯的根源腫瘤基因異質性的探索及治療仍有很長的路。在目前已知的EGFR-TKI原發和繼發耐葯機制中，T790M突變尤其重要，因此臨牀上應對其檢測給予關注，對於監測療效和指導後續治療提供更多信息。參考文獻：1.Peter C. Nowell. The Clonal Evolution of Tumor Cell Populations. Science. 1976 Oct 1;194(4260):23-8.2.Yap TA, Gerlinger M et al. Intratumor heterogeneity: seeing the wood for the trees. Sci Transl Med. 2012 Mar 28;4(127):127.

3.Inukai M, et al. Presence of epidermal growth factor receptor gene T790M mutation as a minor clone in non-small cell lung cancer. Cancer Res2006;66:7854-8.

4.Sos ML, et al. PTEN loss contributes to erlotinib resistance in EGFR-mutant lung cancer by activation of Akt and EGFR. Cancer Res 2009;69:3256-61.5.Engelman JA, et al. Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer. J Clin Invest 2006;116:2695-706.6.Sharma SV, Lee DY, Li B, et al. A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations.Cell 2010;141:69-80.7.Bivona TG, et al. FAS and NFκB signalling modulate dependence of lung cancers on mutant EGFR. Nature 2011;471:523-6.8.Gong Y, et al. Induction of BIM is essential for apoptosis triggered by EGFR kinase inhibitors in mutant EGFR-dependent lung adenocarcinomas. PLoS Med 2007;4:e294.9.Hata AN, et al. Tumor cells can follow distinct evolutionary paths to become resistant to epidermal growth factor receptor inhibition. Nat Med. 2016 Mar;22(3):262-9.

EGFR與EML4-ALK基因突變共存型非小細胞肺癌1例

近年來，驅動基因是非小細胞肺癌（NSCLC）研究的熱點，尤其在肺腺癌，已經取得了可喜的成果。其中表皮生長因子受體（EGFR）、棘皮動物微管樣蛋4?間變淋巴瘤激酶（EML4-ALK）及K?Ras等基因的研究結果逐漸改變了人們對NSCLC發生、發展生物學本質的認識，針對上述靶點的靶向幹預，可以說是NSCLC 治療史上一個重要「里程碑」。然而，隨著越來越多驅動基因被相繼發現，NSCLC是由單個驅動基因主導，還是雙驅動基因或者多驅動基因共同演繹等問題，正困擾著目前的研究者及臨牀實踐，進一步探索或尋找更多證據解答上述問題，是該領域的當務之急。現報告1例EGFR基因突變與EML4-ALK重組共存的患者，希望對這類患者的治療提供一定的指導。病案摘要患者男性，68歲。因「反覆咳嗽3個月，進行性加重伴胸悶1周。於2013 年5月27日就診於我院。既往高血壓病史20年；無吸煙、飲酒史；否認家族中有腫瘤患者。PET-CT檢查示：左下肺門佔位，考慮中央型肺癌伴阻塞性炎症、不張；兩肺內多發轉移；左下胸膜及左頸根部、左側鎖骨上窩、縱隔內、左肺門多發腫大淋巴結，肝臟、多發椎體及附件骨轉移；左下胸腔積液；顱內多發轉移竈。癌胚抗原（CEA）404.8 ng/ml。左頸部淋巴結切除活檢，組織病理免疫組化（圖1）示：TTF-1（++++）、CK7（++++）、Ki-67（40%）、p53（+）、ALK（++）、CK5/6（-），支持實性腺癌來源於肺部。擴增阻滯突變系統多聚鏈酶式擴增（ARMS-PCR）法檢測顯示，EML4-ALK（外顯子13，6a/b、20） 位點融合，EGFR 基因19（del）位點突變。圖１ EGFR與EML4-ALK基因突變共存型NSCLC患者的常規病理染色（HE×200）及免疫組化染色（SP ×200）2013年6月28日開始接受厄洛替尼（150 mg/次，口服，1次/日）治療；7月30日複查胸腹CT示：肺內、肝內病竈增大、數目增多，鎖骨上、下淋巴結增大（圖2）。按照RECIST1.1療效評價標準評價為疾病進展，改用克唑替尼（250 mg/次，口服，２次/日）治療，口服2個月後，療效評價為穩定。患者目前仍在隨訪中。

圖２　EGFR與EML4-ALK基因突變共存型NSCLC患者厄洛替尼治療前、後的CT增強掃描影像討論NSCLC 中單純EGFR 的突變率為40％～60％，突變型患者的預後較野生型差，EGFR突變人羣主要為亞裔女性、既往無或者輕度吸煙者、腺癌患者。2007年首次在NSCLC 中發現ALK重排，之後發現NSCLC 單純ALK重排的發生率為3％～13％。重排型患者的預後比無重排型患者差，ALK重排患者的臨牀病理特徵與EGFR 突變者相似，但又有其獨特的病理特徵，如印戒細胞成分、黏液篩孔狀結構和顯著的細胞外黏液成分分泌。多項研究顯示，NSCLC中EML4-ALK重排與EGFR 及K?Ras突變是互為獨立的、不共存的分子事件。最近發現ALK重排和EGFR 突變在同一腫瘤組織中共存，其發生率為1％～6％，目前共存型患者的病理臨牀特徵以及預後缺乏相關循證醫學證據。EGFR 與EML4-ALK 基因突變共存型NSCLC 患者的靶向藥物（EGFR?TKIs和ALK抑製劑）如何優化，尚缺乏統一的共識。從目前的個案報道中，我們發現大多數患者優先選擇EGFR?TKIs，進展後再換用ALK抑製劑。EGFR?TKIs是單純EGFR 突變的晚期NSCLC 患者的一線用藥，其有效率為70％～80％，且無進展生存時間達９～14個月 ；然而共存型患者對EGFR-TKIs的敏感性不一致。Chen等報道1例EGFR 基因19位點缺失、ALK無重排的患者，接受厄洛替尼治療11個月後出現進展，第2次活檢行頸部淋巴結活檢分子病理提示EGFR 基因19位點缺失、ALK重排，提示ALK 重排可能是EGFR?TKI 獲得性耐葯的一個機制。lee等報道了共存型患者對EGFR-TKIs 治療無反應。本例患者對厄洛替尼亦不敏感，說明ALK 重排也可能是EGFR-TKIs 原發耐葯的一個機制。然而，有學者報道接受EGFR-TKIs 治療前明確為共存型的患者對EGFR-TKIs治療均有反應，但後期均出現對EGFR-TKIs耐葯，其耐葯機制尚未見報道。ALK重排是預測克唑替尼療效的一個生物標記物，對於單純ALK重排患者，使用克唑替尼的客觀緩解率為65.3％，而共存型患者對於ALK 抑製劑的敏感性目前尚不清楚。目前研究報道共存型患者接受EGFR-TKIs治療進展後，更換為克唑替尼治療，均對ALK 抑製劑敏感。然而體外實驗研究表明，EGFR 信號通路異常活化是ALK 抑製劑對細胞的耐葯機制之一。上述兩種情況相矛盾，因此有必要進一步探索共存型患者對ALK 抑製劑敏感性的研究。總之，由於報道較少，共存型患者的分子病理特點是由腫瘤本身存在異質性或者細胞生物特性引起，還是檢測手段導致假陽性的出現目前尚不清楚。在靶向藥物治療的優化上，大多數傾向優先選擇EGFR-TKIs，進展後再給予患者ALK 抑製劑，必要時再行病理檢測。今後應該更側重對共存型患者生物學行為及相關臨牀病理特徵和共存型患者對EGFR-TKIs 和ALK 抑製劑敏感性不一致原因的研究，以及如何更好地優化靶向藥物的選擇；同時目前報道的檢測手段不一致，有導致假陽性發生的可能，因此對於共存型患者檢測手段的探索也是非常必要的。case.medlive.cn/cancer/

研究者視角：NSCLC瘤內異質性研究 JCO之路

作者：蔡微菁、林冬梅、武春燕、李雪飛、趙超、鄭立謀、揣少坤、費苛、周彩存、Fred R.Hirsch通訊作者：周彩存採訪對象：蔡微菁（此研究第一作者）腫瘤資訊： 您的研究主要是關注了非小細胞肺癌之中驅動基因的瘤內異質性的問題，您能向我們簡要介紹下您在這個研究中的重要發現嗎？蔡微菁博士：首先，我們這個研究主要是關注於非小細胞肺癌驅動基因的腫瘤異質性，主要有一下三點發現：1，揭示了腫瘤異質性是目前腫瘤耐葯的重要原因之一。腫瘤的瘤內異質性如EGFR的瘤內異質性已經被很多的研究證實了，而我們的研究則證實了ALK融合基因也存在腫瘤異質性，眾所周知，ALK融合基因和EGFR突變是目前非小細胞肺癌最重要的兩大驅動基因，以上基因的瘤內異質性提示此異質性可能普遍存在於腫瘤當中，這一點仍需更多的研究來證實；2， 我們的研究發現了2例雙驅動的非小細胞肺癌患者，我們假設雙驅動的腫瘤並不是每一個腫瘤細胞都含有這2種驅動基因，而可能是與腫瘤不同克隆來源的腫瘤細胞的分化發展有關，也就是說，有一部分亞克隆來源的腫瘤細胞可能是含有某一種驅動基因，另一些還有另一種，有一部分是兩者都有，甚至有一部分是兩者都沒有。我們用不同的檢測手段證實了這一假設；

3， 肺腺癌的組織異質性非常高，這一點已得到廣大研究者尤其是病理科研究者的認可，然而，大家並未意識到它的分子異質性也是很高的，意味著病理與分子的異質性是共存的，但這種共存目前尚無規律可循，尚需更多的研究來探索。

腫瘤資訊：肺腺癌的研究進展和治療進展日新月異，從研究者的角度，您認為這項研究對於臨牀治療會有哪些啟示？蔡微菁博士：我們剛剛講到，靶向藥物可以給患者很大的收益，但是總生存時間的獲益卻仍不顯著。所以在既往的研究中，我們把耐葯機制的探索集中在二次突變或者信號分子的調控上面。而我們這個研究是向大家揭示異質性可能也是靶向藥物耐葯的一個很重要的機制之一。腫瘤的發生和發展是一個非常動態的過程，我們不能用臨牀上某一時間點對某一部位的一次活檢來指導患者自始至終的整個治療，這達不到精準治療的要求，患者也達不到最大的獲益。所以，我們瞭解到它存在動態異質性，異質性跟動態發展有關，也就是不同亞克隆來源的腫瘤細胞有不同的分化發展過程，在治療選擇和微環境改變的情況下，它有可能此消彼長，新優勢生長的克隆亞羣對靶向藥物耐葯，提示臨牀上可能還是需要多點活檢或多次活檢，不能用某一時間段的活檢來指導整個治療過程。這是本研究的主要提示。除此之外，雙驅動越來越多的被診斷出，而此類患者的治療方式卻仍無定論。我們的研究為此類患者的治療提供了一定的理論基礎，而其應用於臨牀仍需後續研究證實。藥物的疊加勢必帶來副作用的疊加，這都需要臨牀實驗來確定。最後，本研究提示我們，腫瘤的複雜程度不可小覷。在抗擊腫瘤的過程中，我們需要考慮得更為全面，研究得更為深入。而我們所做的也只是拋磚引玉，僅僅揭示了腫瘤異質性的冰山一角。腫瘤資訊： 在您的研究中，涉及大量的標本檢測工作，包括對於組織標本的微切割，能談談看您認為在進行這項研究的過程中，您遇到的最大困難嗎？您是如何克服這些困難的？蔡微菁博士：我們的研究是在組織異質性的基礎上假設分子異質性的存在，最大的困難在於研究的實驗設計。在我的導師周彩存教授的指導下，整個研究的設計與執行都走向了非常正確的方向。除了研究設計以外，最大的困難是涉及的樣本的顯微微切割。因為本研究需要我們要在顯微鏡的直視下，在區分腺癌亞型的情況下進行區域的分割，區別於傳統的顯微微切割，我們的切片厚度只能是傳統的一半；但是，另一方面，我們又要保證切割到的腫瘤細胞足夠多，它的生長形式足夠單一，以便我們進行下一步的分析和檢測，做到這兩點的平衡還是很難的。為了要精確地掌握這一點，我們歷經了無數次預實驗和無數次失敗才掌握這一點，非常熟練掌握了之後再進行有效的切割。這個過程當中，病理科的林冬梅教授對我們的幫助非常大，她對我們的指導，對於病理切片精確的讀片，是對我們的實驗能夠進行和完成非常重要的一個保障。她的工作在本研究中起到了不可或缺的作用。腫瘤資訊： 如果有其他學者也在從事肺癌的轉化研究，希望您給到1-2點建議的話，您會做什麼樣的建議？蔡微菁博士：這個研究的過程告訴我們，研究不是獨立存在的，而是相互關聯。就像本研究即建立在我們前期對融合基因的一系列探索之上。不斷地遇到的問題，才會不斷地提出新的假設進而去驗證。所以我很想和研究的同行分享一點：研究需要專一，在一條道路上比較專註地，由淺入深地，把自己的東西做好，就是要專心致志地做自己的東西，不能急於求成，不能一口氣喫成胖子，這是一個很漫長的過程。新的發現勢必建立在舊的基礎之上。即使我們現在所取得的成果也是建立在無數次的失敗與探索之上，許多前人對於雙突變以及異質性的研究也對我們很有指導意義。我們的研究也是為今後的人提供了基礎和參考，供人超越，研究也是一種傳承。liangyihui.net/doc/d ... mp;isappinstalled=1

ALK陽性非小細胞肺癌克唑替尼的耐葯機制及應對策略

間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因是繼EGFR基因突變後在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中發現的又一具有針對性靶向藥物治療的腫瘤驅動基因。針對ALK融合基因的靶向治療藥物——克唑替尼，在短短4年內即經歷從臨牀前研究、早期臨牀研究到批准上市的歷程，是靶點明確、檢測方法成熟的靶向藥物成功的典範。然而，一如EGFR突變基礎上的EGFR-TKIs治療耐葯不可避免，儘管克唑替尼在ALK陽性患者獲得良好的無進展生存和客觀有效率，最終還是難逃耐葯而治療失敗的命運。有關ALK+NSCLC靶向治療的耐葯機制及治療策略已經成為目前的熱點。一、ALK+NSCLC獲得性耐葯的機制ALK基因重排發生於3%-7%的NSCLC，更多見於非吸煙的較年輕腺癌患者，通常與EGFR或KRAS突變的發生互相排斥。NSCLC患者ALK基因重排的發現極大改善了該類亞型患者的臨牀預後。克唑替尼治療的客觀有效率（objective response rate，ORR）達60%，無進展生存（progression-free survival，PFS）達8-10個月，總生存顯著延長。儘管ALK+肺癌患者的獲益明顯，但這部分患者往往在1-2年內出現對克唑替尼耐葯，且中樞神經系統的複發進展較為常見。其耐葯機制是多種多樣的，可分為兩大類：ALK耐葯突變和其他信號通路的轉換（即信號旁路的激活）。已發現的耐葯機制主要有以下幾種：1. ALK耐葯突變

（1）?ALK激酶區突變：已有體外及基於患者標本的研究揭示部分ALK+肺癌患者對克唑替尼的耐葯機制，其中最早明確的耐葯機制是ALK激酶區突變。眾所周知，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變陽性患者最主要的耐葯機制是T790M突變，與之不同的是，ALK基因重排患者中已鑒定出數種ALK激酶區突變，數量上略微佔優勢的為L1196M，一種類似於T790M的看家基因。事實上，已在ALK激酶區鑒定出多種不同的氨基酸位點突變，包括L1196M，G1269A，S1206Y，G1202R，1151Tins，L1152R和C1156Y。Doebele等對14例經克唑替尼治療出現獲得性耐葯的ALK+NSCLC患者的標本進行檢測，發現三分之一患者出現了ALK激酶區的二次突變。與之相似，Katayama等對18例克唑替尼獲得性耐葯的患者進行臨牀和分子生物學特點進行分析，提示約三分之一患者出現了ALK激酶區的二次突變或ALK基因擴增，並且在體外實驗中證實了這些突變導致了對克唑替尼的耐葯。

耐葯突變的多樣性給患者和醫生提出了挑戰。首先，尋找能夠鑒定所有已知突變的精確檢測方法非常困難。其次，在出現耐葯時，腫瘤組織可能具有不止一種突變。在首例公開報道的克唑替尼耐葯病例的同一個腫瘤樣本中即發現兩種不同的突變（C1156Y和L1196M）。當腫瘤標本具有多種突變時，如果在大部分腫瘤細胞中沒有一種佔主導地位的突變，直接測序法可能會得出假陰性的結果。（2）?ALK融合基因拷貝數增加：ALK融合基因拷貝數增加首次是在ALK+細胞系出現對克唑替尼耐葯時發現。其後在對克唑替尼耐葯的患者標本中亦發現拷貝數的增加，提示其在腫瘤細胞耐葯中可能具有一定的作用。當ALK融合基因激酶區突變或拷貝數增加時，ALK信號通路往往會保留，因此預期腫瘤細胞仍具有對ALK融合基因的成癮性。這樣，更強有效的第二代ALK抑製劑也許能夠克服此種細胞耐葯機制。該類型耐葯被稱為ALK-佔優勢的耐葯。2.?信號旁路的激活（1）其他信號通路的轉換（信號旁路的激活）：還有一種類型被稱為其他信號通路的轉換（信號旁路的激活），主要是指其他信號通路出現取代了腫瘤細胞對ALK通路的依賴，導致ALK抑製劑不能充分抑制腫瘤細胞生長。該類型耐葯又被稱為ALK-不佔優勢的耐葯。已鑒定出多種替代的信號通路，如：在未接受克唑替尼和已接受克唑替尼治療的患者中均發現激活的EGFR或KRAS突變的存在。體外研究提示，EGFR和其他的HER家族受體酪氨酸激酶能夠通過配體介導激活ALK受體而導致耐葯。其中佔第一位的信號旁路即EGFR通路，在多項研究中均有報道。在麻省總醫院18例對克唑替尼獲得性耐葯的標本中，17例標本經免疫組織化學方法檢測出EGFR磷酸化，提示存在不同程度的EGFR通路激活。更重要的是，在細胞系研究中發現，抑制EGFR可使耐葯細胞系對克唑替尼恢復敏感性。第二位被激活的信號旁路是c-KIT通路。在麻省總醫院18例對克唑替尼獲得性耐葯的標本中，2例標本經FISH方法檢測發現高水平的c-KIT基因擴增。進一步通過免疫組化確認存在c-KIT過表達。另外，通過免疫組化法還發現在耐葯標本實性成分的間質細胞中c-KIT配體幹細胞因子（SCF）表達增加。體外實驗證實c-KIT過表達需要SCF來促進其耐葯，而該種耐葯可通過聯合伊馬替尼與克唑替尼而逆轉。（2）腫瘤的異質性：當試圖克服ALK+肺癌對克唑替尼的耐藥性時，腫瘤異質性導致這一問題更加複雜。事實上，已在多種細胞耐葯上觀察到腫瘤的異質性。一個患者的標本中鑒定出兩種不同的激酶區突變，而有一部分腫瘤細胞不存在突變。另外一個患者的標本同時鑒定出拷貝數增加和突變，但目前並不知道這些變異是否都存在於相同的細胞內。還有，一個患者同時進行了兩個不同病竈的活檢，顯示出每個活檢部位存在不同的分子結果。問題就不可避免的出現了：一小塊活檢組織的分子檢測結果能否代表整個腫瘤組織，目前的有限的分子檢測能否揭示所有細胞耐葯的類型。這將使耐葯後的分子機制的檢測和制訂相應的治療策略更加複雜化。二、克服ALK+NSCLC獲得性耐葯的藥物與策略1.第二代ALK抑製劑 臨牀前研究已證實，第二代ALK抑製劑（如CH5424802）不僅對於存在EML4-ALK融合基因的腫瘤細胞具有活性，而且對已鑒定出來的多種ALK激酶區耐葯突變均具有活性。LDK378、AP26113和CH5424802的早期臨牀前數據提示這些藥物對未接受克唑替尼治療和克唑替尼耐葯的患者均具有活性，並且每種藥物均有部分數據支持其對腦轉移竈有效。LDK378是由諾華公司研發的ALK抑製劑，體外研究發現其對ALK酶的半抑制濃度（IC50）僅為0.15nM，而對照藥物克唑替尼則為3nM，顯示出針對ALK的較好活性。進一步在對ALK耐葯細胞系研究，提示該葯較克唑替尼有更好的活性。基於此，研究者設計了Ⅰ期臨牀研究（NCT01283516），篩選ALK陽性的經過標準治療失敗的進展期腫瘤患者入組，LDK378的劑量由50mg/d爬升至750mg/d。研究共入組131例患者，分為3組：之前接受過ALK TKI治療的ALK+肺癌，之前未接受過ALK TKI治療的ALK+肺癌和ALK+的除肺癌之外的其他惡性腫瘤。截止2012年11月8日，共入組130例患者，其中59例為劑量爬坡組，確認最大耐受劑量（MTD）為750mg/d；後續71例患者為MTD擴展組。接受LDK378劑量範圍為400~750mg/d的114例NSCLC患者可評價療效，ORR為58%（66例經過療效確認，尚有20例療效未經確認，未計算入內）。在79例對克唑替尼耐葯的ALK+NSCLC亞組中，ORR為57%（45例經過療效確認，17例療效未經確認，未計算入內）。剩餘35例未經克唑替尼治療的ALK+NSCLC組中，ORR為60%（21例經過療效確認，尚有3例療效未經確認，未計算入內）。研究顯示LDK378對患者中樞神經系統病竈亦有較好的療效。在全組114例NSCLC中，中位PFS為8.6個月（95%可信區間：5.7~9.9）。最常見的不良反應（n=130）為噁心（73%），腹瀉（72%），嘔吐（58%）和乏力（41%），最常見的G3/4不良反應為丙氨酸氨基轉移酶（ALT）升高9%），門冬氨酸氨基轉移酶（AST）升高（10%）和腹瀉（8%）。該項研究結果表明LDK378在400~750mg/d劑量範圍內顯示出較強的抗腫瘤活性（無論其是否接受過克唑替尼治療），並且對中樞神經系統病竈亦有活性；最常見的不良反應為噁心，腹瀉，嘔吐和乏力，且多為1或2級，患者耐受性佳。經FDA批准，LDK378正在進行多項Ⅱ期和Ⅲ期臨牀研究。CH5424802是由中外製葯公司研發的第二代ALK抑製劑之一，在日本進行的Ⅰ/Ⅱ期臨牀研究中，最大耐受劑量組共納入46例ALK+且未接受過克唑替尼治療的NSCLC患者，其中43例獲得客觀緩解（2例為CR，41例為PR），客觀緩解率93.5%，CI 82%~98.6%。12/46（26%）患者發生3級以上不良反應，包括中性粒細胞減少和血液肌酸激酶含量升高。AP26113是由阿瑞雅德製藥公司研發的新型小分子靶向藥物，為ALK和EGFR雙靶點抑製劑，同樣在早期研究中顯示出針對ALK+NSCLC患者較好的療效，客觀有效率高達73%，無論之前是否接受過克唑替尼治療。綜上，第二代ALK抑製劑對於仍依賴於ALK信號通路作為驅動基因的腫瘤也許是最佳的選擇。2.合理的聯合治療或化療 由於尚存在信號旁路激活所導致的耐葯，同時應用ALK抑製劑和其他信號傳導通路，有可能改善臨牀療效。具有前景的策略包括：ALK抑製劑聯合熱休克蛋白90（HSP 90）抑製劑/MEK抑製劑/mTOR抑製劑/EGFR抑製劑。其中一個有前景的治療策略是利用Ganetespib藥物阻斷分子伴侶熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）。在體外細胞系研究中發現Ganetespib對ALK+的未經過克唑替尼處理或對克唑替尼耐葯的細胞系均有活性。HSP 90抑製劑能夠促進腫瘤信號通路蛋白的降解，例如ALK（涉及腫瘤細胞的增殖和存活），為克唑替尼耐葯但未發生二次突變患者的患者提供了一種可能的治療策略。一系列聯合HSP90抑製劑與選擇性ALK抑製劑的臨牀研究正在進行中（NCT 01712217和NCT01579994）。對於ALK+NSCLC，何種化療藥物是最佳的選擇，已有多項研究報道，結果顯示克唑替尼對ALK+肺癌的ORR可高達65.7%（n=172），而培美曲塞方案化療ORR僅為29.3%（n=99），多西他賽方案療效最差，ORR僅為6.9%（n=72）。含培美曲塞的方案顯示出對ALK+肺癌的較好活性，當對克唑替尼耐葯的患者不能參加其他臨牀研究時，培美曲塞亦可作為合理的選擇之一。在EGFR突變陽性NSCLC患者對EGFR TKI耐葯後的相關研究發現，立即停止EGFR TKI治療可導致腫瘤出現「暴發性進展」或稱之為「閃耀」現象，可能的原因是停止EGFR TKI治療後，對EGFR TKI敏感的快速生長細胞再次增殖，導致腫瘤暴發性生長。與之相似，對克唑替尼敏感的ALK+NSCLC亦可能出現相似的過程。因此，當該類患者出現對克唑替尼獲得性耐葯時，在全身化療同時是否需要繼續克唑替尼治療，尚無確切答案，通過一些前瞻性臨牀研究有助於回答這一問題。正在設計的SWOG1300研究即是針對ALK+患者出現克唑替尼耐葯後隨機分配至培美曲塞單葯或培美曲塞與克唑替尼聯合治療組。值得關注的是，在這項研究中，如果單葯培美曲塞治療失敗後，將允許患者再次接受克唑替尼治療。基於此研究，亦能回答「在具有明確腫瘤驅動基因的患者出現獲得性耐葯後，兩種不同的治療模式孰優孰劣（繼續原小分子靶向藥物聯合全身化療vs先全身化療，待疾病再次進展後重新「挑戰」小分子靶向藥物——rechallenge）」這一問題。研究結果對臨牀實踐具有重要的指導意義，我們將拭目以待。3.不同耐葯模式的治療策略 當具有驅動基因的NSCLC接受靶向藥物治療出現疾病進展時，應根據不同的情況制定後續的治療策略。對於靶向藥物治療出現獲得性耐葯的這部分病人，一個重要的觀點是認為這種耐葯往往不完全，因此當疾病進展時，仍有部分腫瘤細胞能夠繼續被靶向藥物所抑制。在更改治療方式之前，區分出僅可檢測的疾病進展與臨牀顯著進展非常重要。這是由於某些患者雖然出現了局部的、無癥狀性進展，但與接受靶向治療之前相比，腫瘤負荷仍能有較好的控制。還有些病人發現疾病進展後停用TKI，出現了疾病暴發性進展。這時予患者同一種TKI或作用於同一靶點的不同種TKI，疾病可再次獲得良好控制。該現象說明TKI仍能抑制對其敏感的腫瘤細胞亞羣。因此，區分不同的耐葯模式對後續治療至關重要。疾病進展僅出現於侷限的一個或幾個病竈時，利用局部治療手段（如放療、手術或射頻消融治療）同時繼續克唑替尼似乎是更佳的選擇。其中最具有代表性的範例即是局部腦轉移的進展。患者往往除腦部病竈外，全身病竈均控制尚可，而腦轉移竈進展可能是由於血腦屏障的存在，導致腦脊液中TKI藥物濃度較低所致。如疾病僅僅是緩慢或非常小的進展，建議繼續目前的治療，並密切隨訪。如疾病出現迅速廣泛進展時，說明TKI已經不能抑制腫瘤生長，建議停用靶向藥物治療。對於此類病人，再次活檢可能會發現組織學改變或新的突變，有助於據此來選擇有效的藥物。腫瘤驅動基因的發現及相應靶向藥物的應用，極大地改善了患者的預後。然而，腫瘤細胞之固有特點必將使得治療之路漫漫且修遠，吾輩仍需上下求索！


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