一文帶你看遍當今的基因治療（1）
基因治療方案和藥物在全球範圍內接連獲批，2017年美國接連批准了三項基因治療的上市，兩個基因治療方案和一個直接給葯型的基因治療藥物。國內也不遑多讓，12月8日至12月29日，已有多達5家企業的申報獲得受理，另有一些公司也在積極布局CAR-T免疫療法，有望在2018年申報臨床。
基因治療重返中心舞台，本文帶你迅速瀏覽當下全球的基因治療現狀。
編譯：劉海燕博士
文章來源：五加和分子醫學（ID: fiveplusMMI)
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一文帶你看遍當今的基因治療(1)
1、基因治療，直面挑戰
世界上第一個獲得授權的基因轉移研究誕生在1989年的NIH（National Insititutes of Health, 國立衛生研究院）。在這項標誌性的研究中，腫瘤浸潤的淋巴細胞被收集起來，用逆轉錄病毒進行遺傳標記用於檢查這些細胞的「腫瘤歸巢」能力。這一研究為證明「遺傳改變的人類細胞回輸入病人體內後並不對人體造成傷害「提供了第一個直接證據。截止到2012年6月，全球已有31個國家共1843例臨床試驗已獲授權、啟動或已完結。
回顧過往，2007年僅有28個國家的1309例臨床試驗，而2004年僅有24個國家的918例臨床試驗。有意思的是，儘管試驗的總數量在逐步增長，但這期間的增長率卻在輕微放緩。另外一個值得注意的差別在於進入臨床試驗晚期的試驗比例，絕大多數的臨床試驗仍然停留在臨床I期和臨床I/II期。
這些絕大多數的早期臨床試驗為基因治療提供了無價的概念驗證，確認了對目標細胞定向改變能夠成功的引起細胞表型的變化。然而在大多數的臨床功能試驗中，基因改造細胞的數量還不足以達到治療的效果。
儘管治療效果欠佳的報告數量有所增加但基因治療領域仍在繼續發展。其中最值得注意的是幾種疾病，如原發性免疫缺陷、萊伯先天性黑蒙症、血友病B、X連鎖的腎上腺腦白質營養不良（X-ALD）的治療。X-ALD是一種致命的脫髓鞘中樞神經系統疾病，一部電影《洛倫佐的油》使得這一疾病為人所知。這是慢病素載體被成功應用於治療人類的基因缺陷病的首次報道，也是嚴重的中樞神經系統疾病治療史上的巨大成功。
也有首次使用免疫治療方法成功的臨床試驗報道，雖然接受治療的患者人群在2012年還很少。這些試驗中，患者接受了工程改造後能夠識別腫瘤的T淋巴細胞，T淋巴細胞的這一功能是γ-逆轉錄病毒載體編碼的直接針對腫瘤相關抗原的T細胞受體所賦予的。總體而言，臨床反應變化多端，但重要的是，一小部分患者在接受治療後得到了緩和。嵌合抗原受體（CARs）在2012年時，作為基於自身靶向腫瘤相關細胞表面抗原的自體細胞療法進已進入臨床。費城阿拉伯森癌症研究中心的研究人員描述了18例患有慢性淋巴細胞白血病的病人中3例在接受自體淋巴細胞治療後獲得的良好早期結果。
2、基因治療的趨勢與當前進展
CAR-T細胞
自2012年開始，全球新增基因治療臨床試驗754例。其中最引人注目的領域當屬利用CAR-T細胞靶向腫瘤相關細胞表面抗原的腫瘤的免疫治療。這一方案已受到廣泛關注，在許多其他腫瘤治療方案已經失敗的情況下它能夠匯聚細胞毒T細胞的殺傷潛力和持久性與單克隆抗體的特異性以殺傷腫瘤。
從2011年新英格蘭醫藥雜誌報道了一例病人接受轉導了能夠表達B細胞特異性抗原CD19的自體T細胞輸注後達到完全緩解後，已有數百名患者在多次試驗中接受了CAR-T 19 這一激動人心的治療方式，在患有白血病或淋巴瘤尤其是急性淋巴白血病的患者中達到了前所未有的緩解率。這一療法走向臨床成為「免疫療法」，被科學雜誌評為2013年的突破性進展。
值得注意的是，到2017年5月，Emily Whitehead 作為首個在費城兒童醫院接受CAR-T細胞治療的兒科患者已經5年沒有複發，並且首個CAR-T細胞產品-Kymriah也在2017年被FDA批准上市。靶向實體瘤如膠質母細胞瘤是目前治療中的一大挑戰，相關報道正日益增加。
Cellectis正致力用TALEN技術編輯健康人來源的T細胞嵌合抗原受體（CAR），以利用健康人的血液獲得「現成」的免疫療法產品。這一通用CAR-T的臨床試驗於2017年2月獲得FDA的批准，但由於出現受試者死亡案例，於2017年9月被FDA叫停。患者的死因指向了治療靶點CD123的選擇，而並不在於對「通用型」CAR的免疫反應，因兩名患者均未報道有GvHD移植物抗宿主反應。目前這款通用型CAR-T的研發仍然處於不確定狀態，但利用健康人血開發「通用」的腫瘤免疫療法對於免疫力低下而無法在自身血液中獲得足夠的T淋巴細胞的腫瘤患者而言仍是一個重要的發展方向。
如今，美國已將CAR-T療法納入醫保，FDA也批准了全球首款CAR-T療法Kymriah的第二個適應症——複發或難治性大B細胞淋巴瘤。好消息仍在不斷傳來，cell雜誌報道了一款SUPRA CAR-T。SUPRA CAR-T將T細胞從系統的靶點感知部分（the target-sensing portion of the system，SUPRA CAR-T系統中用於識別癌細胞上靶點的抗體部分）分離了出來，使系統擁有了切換靶點的能力。這一款通用型CAR-T是一種分離的、通用、可編程式(split,universal, and programmable，SUPRA)CAR 系統，用於T細胞治療。能夠很好地調控T細胞激活程度以消除毒性;能夠感知多種抗原並做出響應以對抗癌症複發;還誘導控制細胞類型特異性的信號。這一系統的出現有望提供更安全、更有效的癌症治療。
單基因遺傳病
自上次報道以來，單基因遺傳病在治療方面有了極大的穩步進展。截止2017年11月，11.1%的臨床試驗集中在單基因遺傳病領域，而其在2012、2007和2004的歷史數據分別為全部試驗的8.7%、8.3%和9.8%。
非病毒載體
在囊性纖維化的治療中，非病毒的基因治療能夠改善肺功能的概念已經一個隨機的、雙盲、安慰劑對照的臨床 IIB 期試驗驗證。這一試驗中，78 例患者接受了陽離子脂質體包裹的編碼 CFTR cDNA 的質粒 DNA 的轉導。儘管收效甚微並且僅在個別受試者身上起效，但這一試驗證明了其安全性並為未來試驗的改進如增加劑量和頻次打下了基礎。
γ-逆轉錄病毒載體
針對免疫缺陷的臨床試驗仍在繼續顯示其顯著的臨床效果，超過150例合併缺陷患者接受了γ-逆轉錄病毒和最近基於慢病毒的基因轉移治療。在腺苷脫氨酶缺乏症（ADA-SCID）的治療方面，超過40例患者接受了治療，疾病的存活率超過70%。
值得注意的是，Struimviv（葛蘭素史克公司），基於里程碑式的米蘭試驗已於2016年獲得了歐洲市場授權局（EMA）的市場批准，代表了第一個靶向幹細胞的的基因治療體外方案在歐洲獲批。儘管經過長期的追蹤在ADA-SCID的治療中並沒有觀察到與載體的基因毒性相關的不良事件，但使用慢病毒進行治療的臨床試驗逐漸增多。使用慢病毒對原發性免疫缺陷如X連鎖重症免疫缺陷（X1-SCID）和Wiskott-Aldrich的治療也有報道，並顯示出相對於γ-逆轉錄病毒載體更好的安全性。
慢病毒載體
慢病毒載體在靶向造血幹細胞治療遺傳性神經疾病ALD和異染性白質營養不良中的應用也取得了可喜的成果，並且類似的方法也被用於血紅蛋白病的治療，包括鐮狀細胞病患者的早期報道。
在藍鳥生物贊助的一項試驗中，治療後15個月，鐮狀球蛋白β抗體的水平約為β球蛋白的一半，疾病表徵也得到了糾正。β地中海貧血的基因治療，尤其是那些還殘存β球蛋白表達的病人的治療報道也令人充滿希望，全球範圍內目前已經開展了六項臨床試驗。
2018年4月19日新英格蘭醫學雜誌發表了哈佛醫學院Leboulch等研究組用BB305載體轉導的自體CD34 +細胞的基因治療減少或消除了對22名患有嚴重β地中海貧血的患者長期紅細胞輸血的需要，而沒有與藥物產品相關的嚴重不良事件。新英格蘭醫學雜誌對這一里程碑式的試驗成功給予了高度讚賞，出版了專門的點評文章。
目前世界上關於地中海貧血的基因治療還有兩項臨床試驗正在進行中。由Meorial Solan Kattering醫院主導的臨床試驗使用了相對溫和的清髓預處理方法，也獲得了與哈佛醫學院相似的滿意結果，而國內的地中海貧血基因治療試驗正在廣州南方醫院進行。
AAV載體
基於腺相關病毒（AAV）載體的治療也在臨床相顯現了令人印象深刻的結果，這反映在一些專門的基因治療期刊中關於這一載體系統的特徵性討論中。在這些試驗中值得關注的包括α-1抗胰蛋白酶缺乏症、血友病A和B以及眼科疾病的基因治療。
用於治療脂蛋白脂酶缺乏症的AAV載體在2012年獲得EMA批准後已被uniQure公司市場化為Glybera。而美國第一個基於AAV的基因治療產品voretigene neparvovec被Spark命名為Luxturna，獲得了FDA諮詢委員會的一致認可。該產品將人視網膜色素上皮特異性蛋白65 kDa（RPE65）cDNA遞送到雙眼視網膜下間隙治療視網膜營養不良。在2017年10月19日，FDA授予了Luxturna的正式批文。
自2012年以來，血友病B（凝血因子IX缺失）的第二例臨床試驗已由A C Nathwani和其同事發起（皇家自由醫院）。在該試驗中，使用了血清型AAV8的病毒外殼以期比之前試驗中使用的AAV2獲得更高的基因表達率。
關鍵的是AAV8較之AAV2在人群中的預存抗體水平更低。該實驗中，外周靜脈一次性注射表達凝血因子IX cDNA的由肝臟特異性啟動子啟動的AAV載體，能夠將血漿中凝血因子IX水平提升至治療水平（正常水平的1-6%），這一水平提升呈現劑量依賴性。高劑量注射能夠觀察到短暫的轉氨酶水平升高，隨後經皮質類固醇治療好轉。
更多的血友病B的I/II期臨床試驗使用了天然存在的Padua亢進突變體進行。在這些試驗中，在兩個接受了高劑量載體注射的患者體內觀察到了免疫反應導致的轉基因表達下降，其中一個病人需要轉向傳統的凝血因子IX注射治療，而且從另一方面來講，儘管在10個受試者中觀察到兩個肝酶水平無癥狀的增加，但能夠通過短期皮質類固醇治療來解決。
AAV9血清型的重組AAV病毒藉治療神經性脊髓型肌萎縮症（SMA）162型和聖菲力波綜合征A型（MPS IIIa）走向臨床，說明這種病毒能夠有效地跨越人的血腦屏障，在小鼠模型中也獲得了一致的結果。
3、對基因治療興趣的恢復
近年來，產業和分出公司對基因治療的興趣前所未有，這反映了對這一領域信心的增加。
這些信心來源於基於治療效果的越來越多的報道和首批基因治療產品如EMA2012年批准的Glybera?（uniQure）和2016年治療ADA-SCID的SrimoSmithLe（葛蘭素史克）的上市。
更近一些，諾華研發的首個CAR T細胞治療產品Kymriah（之前名為tisagenlecleucel-T 和CTL019）於2017年8月獲FDA批准。緊接著，由Kite Pharma研發的商品名為Yescarta的CAR-T治療產品和Spark Therapeutics 的Luxturna分別在10月和12月獲得FDA批准上市。
學術界也獲得了越來越多的行業資助，進一步拓展了基因治療藥物的研發管線。隨著臨床思維的變革，大量的投資開始進入基因治療領域，如優化生產工藝以擴大獲得治療人類疾病所需的病毒載體的生產規模並確保商業化的生產方法對新載體適用。
國內方面，五加和對中國的基因治療提供AAV、HSV、LENTI、ADV載體系統中試及規模化載體生產平台，可以為基因治療產業快速發展提供支撐。臨床醫藥中基因治療的信心增加也引發了生物醫藥領域對於潛在獲利的疾病指征的激烈競爭，以利用AAV載體治療凝血因子缺乏的血友病A和血友病B為例，至少10家公司分別啟動或宣稱計劃開展臨床試驗。
4、進化的技術與新的基因治療平台
基因修復
自2012年以來，一個重要的模式變化在於更多的關注集中在基因補充策略的改變，包括基因編輯和目標基因重組，反義寡核苷酸誘導外顯子跳躍以及RNA干擾，這些方案現已全部進入臨床。
在簡單增加功能正常的基因不足以改善的顯性疾病過程中，這一策略非常重要。RNAi的重要性（例如基因下調基因表達）在2006和梅洛獲得諾貝爾生理和醫學獎時被認可。
雖然這些方法的效率通常不足以進行人類疾病的基因治療，但在使用寡核苷酸誘導的外顯子跳躍治療假肥大型肌營養不良症（DMD）方面和關於SMA治療的典型案例已被報道出來並在最近的分子治療周年紀念版中進行了綜述。
2016，FDA批准了兩種剪接調節寡核苷酸用於治療神經肌肉疾病。第一個是Eteplirsen (Sarepta Therapeutics)，儘管有爭議但仍獲得了FDA的優先審批，用磷醯二胺嗎啉反義寡核苷酸治療DMD。而用於治療SMA患者的nusinersen (由Biogen市場化的Spinraza)則在提出新葯申請後3個月就被接收，並且不需轉至FDA諮詢委員會。
基因編輯
自第一個特異性的核酸酶被證明能夠結合DNA並使雙鏈斷裂以來已近二十年的時間，這極大的促進了位點特異性基因編輯的發展。
核酸酶誘導的基因斷裂不僅可以用基因添加和基因破壞，還可用於基因修復。儘管需要長期隨訪，但基因編輯技術的前景看好，這一技術已被應用於治療HIV-193和轉錄激活因子樣效應核酸酶的臨床試驗中，用以治療兩個患有晚期白血病的兒童。
最近，一種用於細菌免疫系的規則相間的短迴文重複基因簇相關cas9（CRISPR/CAS9）核酸酶顯著提高了基因組編輯的效率，儘管在30年前首次被報道時僅被作為iap基因下游的一組不尋常核苷酸序列。這一細菌免疫系統被重新定義，導致了基因編輯技術的持續革命。根據報道，為了生產更安全的異種移植組織，CRISPR/Cas9已被用於超過60種豬內源性逆轉錄病毒的滅活中。
最近，CRISPR/CAS9修飾的細胞首次用於人類治療癌症。2016年10月28日，四川大學盧鈾團隊將CRISPR/Cas9改造的T細胞輸入病人體內以治療轉移性肺癌（試驗號NCT02793856）,國內還有另外7個針對實體瘤的臨床試驗計划進行。SangaMo療法也開始使用鋅指核酸酶將序列導入白蛋白位點治療粘多糖沉積症和血友病B（試驗號分別為：NCT03041324, NCT02702115 和 NCT02695160）。
儘管仍處於臨床前階段，但使用非同源末端糾正致病性剪接位點突變已被報道用於治療小鼠1A性先天性肌營養不良症並在一些案例中可能最終取代使用寡核苷酸誘導的外顯子跳躍。該技術的進一步改進，如鑒定具有減少的靶向效應的替代核酸酶，已經顯示了其基因治療應用的潛力，但對大量的細胞進行精準的位點修復以獲得治療效果仍是對現有技術的挑戰。
最開始利用CRISPR/Cas9對人類胚胎進行基因編輯的是中國，最近美國也有相關報道。
日益增長的轉基因表達需求
基因傳遞系統可分為兩大類：非病毒的物理化學方法與重組病毒系統。
非病毒方法的比較優勢包括化學特性的簡化、生產的簡單性和再現性、更大的包裝容量和能減少生物安全方面的擔憂。然而與重組病毒系統相比非病毒方法相對低效且往往效果短暫。但核酸穩定性和效力的提高以及脂質和聚合物遞送技術的進步，正在推進非病毒基因遞送系統的發展。
相較與此，為了使病毒系統複製能力缺失、效率更高以及更好的利用其有利的一面，病毒系統常有修改。根據所需修飾的性質，核酸、寡核苷酸、適體、轉錄因子和其他分子的瞬時遞送是非常可能實現的。例如，使用非整合載體、瞬時表達系統和小分子將轉錄因子傳遞到誘導多能幹細胞（iPS），其安全性問題的解決在於消除編碼轉錄因子不必要的長期表達和插入誘變的可能性。通過限制潛在的脫靶效應，Cas9和其他DNA內切酶在基因組編輯中的瞬時表達也可能是有利的，這正在被廣泛地研究。
文章來源：
Ginn S L, Alexander I E, Edelstein M L, et al. Gene therapy clinical trials worldwide to 2012 – an update[J]. Journal of Gene Medicine, 2013, 15(2):65.
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