Science背靠背丨相分離如何促進膜受體信號轉導
撰文丨赤貞
責編丨迦漵
相分離在膜受體及其下游信號轉導通路中常有發生。以T細胞活化過程為例，TCR被Src家族激酶磷酸化後，招募胞內酪氨酸激酶ZAP70，後者磷酸化骨架蛋白上T細胞活化linker（LAT）的酪氨酸位點。磷酸化後的LAT可與接頭蛋白Grb2的SH2/SH3結構域、GEF蛋白的脯氨酸富含域形成互作網路，發生相分離。2016年，著名的Ronald Vale（就是那位研究生期間打破科研記錄一年發表4篇一作cell，26歲拿到PhD，42歲成為雙院院士，研究分子馬達的高富帥）實驗室發現T細胞信號轉導的過程中TCR磷酸化可誘導下游蛋白形成液液相分離，並最終促進肌動蛋白絲（actinfilament）的形成【1, 2】；這一研究首次闡明了相分離對信號轉導有促進作用。
隨著相分離領域的發展，眾多體外實驗逐步揭示相分離的發生主要有兩種機制：一是蛋白內部的無序區自發形成相分離；二是蛋白間通過多價的相互作用，形成穩定的互作網路，從而發生相分離【3】。那麼，膜受體信號轉導中的相分離究竟通過哪種機制發生，這一過程發生的化學計量學依據為何，相分離具體如何調控信號轉導，其意義何為，這些問題目前仍不清楚。近日，Science雜誌背靠背發表了來自UCB和UTSW的兩個實驗室對相分離調控細胞信號轉導的化學計量學研究【4, 5】。
在UCB Jay T.Groves教授團隊的研究中，研究者對（pY）LAT-Grb2-SOS信號通路中的SOS蛋白在TCR磷酸化以後是如何被招募到膜上、並從活性抑制狀態中激活的過程進行了詳盡的分析。SOS蛋白由N端histone fold、Dbl同源結構域、Pleckstrin同源結構域，C端PR（脯氨酸富含域），和催化活性中心REM（Ras交換motif）、CDC25結構域構成【6】。其C端PR與接頭蛋白Grb2的SH3結構域互作，N端則通過分子內及分子間的互作阻擋活性中心發揮作用。研究者通過inteinligation得到了全長的SOS蛋白，通過單分子實驗發現，SOS在被Grb2招募到細胞膜後有兩種形式：招募後活化（activation）和招募後排斥（rejection）。兩種形式分別對應著不同的結構基礎：Activation形式的SOS蛋白通過與PIP2等陰離子脂質互作，開放活性中心，從而激活下游Ras蛋白；而Rejction形式的SOS蛋白則迅速遊離開細胞膜，保持活性抑制狀態。多個單分子實驗的統計結果顯示，Activation形式的SOS蛋白從被招募到活化所需的activation time呈先升後降的gamma分布而非指數分布，提示SOS蛋白的活化過程存在至少一個限速步驟。研究者通過化學計量學推算對這一實驗結果進行了理論驗證，當SOS蛋白活化需經歷一個限速步驟時，其activation time的表達公示為
函數圖像則如圖D。由於SOS蛋白的活化主要是活性中心抑制狀態到活性中心開放狀態的轉變，影響這一轉變的關鍵分子有接頭蛋白Grb2、SOS蛋白N端結構域和PIP2，研究者分別探究了這三者對於activation time的影響。結果發現，Grb2和SOS蛋白N端結構域是維持activationtime gamma分布的關鍵，兩者通過影響SOS蛋白在膜上的駐留時間（dwell time）而維持限速步驟的存在，其具體機制則正是相分離。具體來說，SOS蛋白的PR結構域可與多個Grb2分子相互作用，駐留時間較長（4-6s）的SOS蛋白通過多個Grb2分子與至少兩個LAT分子形成互作網路。在給定LAT及Grb2濃度的情況下，隨著SOS蛋白PR結構域濃度的增加，可觀察到相分離的形成。通過相分離而長時間駐留在膜上的SOS蛋白增加了與PIP2接觸並活化的幾率，相分離中每個SOS分子可4倍激活下游的Ras蛋白。而與單個Grb2分子互作的SOS蛋白在膜上的駐留時間則不到1s，其激活概率大大降低。
相分離調控SOS蛋白的膜駐留時間從而影響SOS蛋白的活化，這一限速步驟在化學計量學中被稱為「動力學校正」（kineticproofreading），其主要意義為防止個別被偶然激活的上游信使分子大規模激活下游信號通路。除SOS蛋白以外，許多膜信號轉導通路相關蛋白也表現出相似的機制，如小G蛋白Rho家族的鳥苷酸交換因子Vav蛋白，Raf蛋白，PI3K，誘導性T細胞激酶和起始肌動蛋白成核的Arp2/3複合物。UTSW Michael K.Rosen教授團隊的研究即對Nephrin-Nck-N-WASP信號通路中的相分離現象進行了描繪。
Michael K.Rosen教授早先報道了腎足細胞、活化的T細胞膜信號轉導過程中存在相分離現象【7, 8】。這一相分離現象起始於在上游信號刺激下跨膜蛋白nephrin/LAT位於胞漿內的無序端被酪氨酸激酶磷酸化，磷酸化的酪氨酸位點可與適配蛋白的SH2、SH3、PRM結構域多價互作，最終形成微米級的相分離液滴。這兩條信號通路的相分離能夠特異性上調適配蛋白Nck及其配體N-WASP和actin成核因子Arp2/3複合物的活性，最終促進肌動蛋白成絲，而其具體如何上調複合物的活性尚不得而知。
研究者首先通過單分子實驗證實pNephrin、Nck、N-WASP分子能夠在體外自發形成液液相分離，且相分離內部肌動蛋白成絲的凈能力（除去蛋白濃度的影響）比遊離狀態下肌動蛋白成絲的能力高14倍。肌動蛋白成絲的過程起始於Arp2/3：WASP2：Actin2複合物組裝成為「母體」肌動蛋白絲，而後WASP從複合物中解聚、Arp2/3複合物不可逆的結合在「母體」肌動蛋白絲上，並開始「子代」肌動蛋白絲的裝配。由於WASP的結合是這一過程中的主要限速步驟，研究者試圖探究N-WASP在細胞膜上的駐留時間是否是影響其活性的主要因素之一。
首先，N-WASP是通過PRM與Nck的SH3結構域互作，從而連接到跨膜蛋白Nephrin的pTyr位點上的，其膜上駐留時間主要受到Nck濃度的影響。但此影響並非完全線性：當Nephrin的pTyr位點被Nck的SH3結構域飽和時，此互作網路最為穩固，N-WASP在膜上的駐留時間最長。其次，單分子實驗證實，當N-WASP直接結合在細胞膜上時，其促進肌動蛋白成絲的能力是通過Nck間接結合在細胞膜上時的40倍余。最後，actin成絲的能力與nephrin-Nck-N-WASP的濃度呈現相似的非線性關係，而與WASP的膜上駐留時間則呈線性正相關。
至此，在腎足細胞的膜信號轉導過程中，pNephrin-Nck-N-WASP通過多價的相互作用形成相分離，而相分離的程度則受分子間相對濃度調節。液液相分離通過增加N-WASP的膜上駐留時間，顯著上調N-WASP的活性，增強其通過Arp2/3複合物促進肌動蛋白成絲的能力。這一機制既抑制了上游通路低活躍水平下干擾信號對下游信號通路的大規模激活，又保證了高活躍水平時對下游信號通路的精細調節，因此在膜受體信號轉導中尤為重要，並成為液液相分離的又一重要生物學功能。
原文鏈接：
Stoichiometry controls activity of phase-separated clusters of actin signaling proteins
http://science.sciencemag.org/content/363/6431/1098製版人：子陽
參考文獻：
1. Su, X.L., et al., Phase separation of signaling molecules promotes T cell receptor signaltransduction.Science, 2016. 352(6285):p. 595-599.
2. Dustin, M.L. and J. Muller, Liquidity in immune cell signaling. Science, 2016. 352(6285):p. 516-517.
3. Banani, S.F., et al., Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology,2017. 18(5): p. 285-298.
4. Huang, W.Y.C., et al., A molecular assembly phase transition and kinetic proofreading modulate Ras activation by SOS. Science, 2019. 363(6431): p. 1098-+.
5. Case, L.B., et al., Stoichiometry controls activity of phase-separated clusters of actin signaling proteins. Science,2019. 363(6431): p. 1093-+.
6. Sondermann, H., et al., Structural analysis of autoinhibition in the Ras activator son of sevenless. Cell,2004. 119(3): p. 393-405.
7. Banjade, S. and M.K. Rosen, Phase Transitions of Multivalent Proteins Can Promote Clustering of Membrane Receptors. Elife,2014. 3.
8. Kim, S., et al., Phosphorylation of Nephrininduces phase separated domains that move through actomyosin contraction.bioRxiv, 2019: p. 558965.
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