撰文 | 小柚

責編 | 兮

N6甲基腺嘌呤修飾，即m6A修飾，是真核生物mRNA上含量最多的修飾類型【1】，參與了mRNA分子經歷的各個階段，包括可變剪接、翻譯、降解等，並調控神經發育、免疫應答、DNA損傷修復等生理過程【2-4】。

如今m6A是RNA表觀遺傳領域的研究熱門，然而自1974年被鑒定【5,6】，m6A也坐了38年的冷板凳，最主要的原因是缺乏對mRNA上具體m6A修飾位點的鑒定方法。

2012年，基於m6A抗體的測序技術，包括m6A-seq, MeRIP-seq【7,8】的開發，使m6A修飾位點的鑒定得以實現，開啟高通量測序對m6A修飾檢測的研究熱潮。該方法為理解m6A的分布和保守性立下汗馬功勞，並促進了m6A的功能和作用機制研究。

然而基於m6A抗體的MeRIP-seq存在局限性：1.解析度較低，只能確定100 nt左右的RNA片段中是否含有m6A修飾。雖然隨後發表的許多研究對MeRIP-seq方法進行了不同程度的優化，試圖提高MeRIP-seq的解析度，甚至達到單鹼基精度【9-14】，然而實際研究中仍然是MeRIP-seq使用更廣泛；2.不能定量，即無法得知甲基化修飾的具體比例，m6A-LAIC-seq通過加入spike-in的方法來彌補這個缺陷；3.需要大量的樣本投入用於免疫沉澱反應，不適於某些珍貴的樣本如早期胚胎或病理樣本，且實驗步驟複雜。因此，需要開發快速準確且具有單鹼基精度的m6A測序方法。

近日，Science Advance和Cell共同發文關注新型m6A 位點鑒定方法。

2019年7月4日，中山大學

駱觀正教授研究團隊在Science Advance發表研究Single-base mapping of m6A by an antibody-independent method，報道了一種新的不依賴於抗體的高通量m6A檢測方法 (m6A-sensitive RNA-Endoribonuclease-Facilitated sequencing, m6A-REF-seq)。

MazF是一種特異性地切割RNA上ACA motif的5端，而不能夠酶切帶有m6A修飾的(m6A)CA motif的RNA內切核酸酶【15】。也就是說，MazF是否切割某段帶有ACA序列的RNA，可反映該RNA是否攜帶m6A修飾。

基於此，研究者在MazF處理後，對酶切的mRNA片段進行修復、連接街頭、PCR建庫測序、通過分析酶切位點是在測序reads的內部還是端點來鑒定m6A修飾位點。為了降低假陽性，研究者使用m6A去甲基化酶FTO在體外處理mRNA作為負對照，只有在FTO處理組中甲基化比例降低的位點才被認為是準確的m6A位點（下圖）。

使用m6A-REF-seq，研究者對HEK293T細胞系mRNA的m6A修飾進行鑒定，得到了4260個高置信度的m6A修飾位點，這些位點的分布與MeRIP-seq測序的結果非常相似，呈現出經典的在終止密碼子附近富集的模式，且主要存在於經典的DRACA或RRACA motif中。

為了驗證驗證該方法的準確性，研究者使用基於連接酶的方法對部分位點進行了驗證。主要步驟是針對特定m6A位點上下游設計probe，由於T3連接酶對m6A修飾位點存在位阻效應，連接效率低於正常A位點，再通過通用引物PCR的方法，即可在瓊脂糖膠上驗證該點是否是m6A修飾位點。同樣以FTO處理樣本作為負對照，m6A-REF-seq的準確性高於基於m6A抗體的測序方法，包括m6A-CLIP, miCLIP-CITS,miCLIP-CIMS和MeRIP，證明該方法有較高的準確性。

該研究通過使用MazF這種能夠特異性區分m6A修飾的內切核酸酶，建立了m6A-REF-seq這個不依賴於抗體的m6A修飾檢測方法，為m6A修飾位點的精確鑒定提供了新的方法。

無獨有偶，6月27日以色列魏茨曼科學研究學院Schraga Schwartz組在Cell發表了論文Deciphering the "m6A Code" via Antibody-Independent Quantitative Profiling，同樣利用MazF酶對m6A修飾的特異性識別，建立了檢測m6A修飾的MAZTER-seq方法，使用了與駱觀正研究組相同的建庫策略。

在MAZTER-seq方法建立後，研究者對所鑒定的m6A位點進行了分析，期望尋找出m6A修飾位點的規律。確實，研究者發現m6A屬於「硬編碼」，即受本身RNA一級核苷酸序列的影響（in cis調控），可通過簡單的方法對33%~46%的m6A位點進行預測。

同時，在MAZTER-seq測序分析中，研究者得到了兩個具有爭議的實驗結果。

1.在小鼠胚胎幹細胞分化過程中，整體m6A水平未發生變化。而2015年Jacob H. Hanna等在Science發表研究m6A mRNA methylation facilitates resolution of na?ve pluripotency toward differentiation，發現METTL3介導的m6A修飾在胚胎幹細胞分化中發揮重要功能。因此，研究者認為METTL3在mESC中發揮的重要作用並不是由於METTL3對m6A位點的重分配造成的，而是由於m6A信息解讀的改變，比如，通過不同的閱讀蛋白。

2.在敲低或過表達FTO後，整體m6A水平無明顯變化。因此研究者認為FTO不是mRNA m6A去甲基化酶，而是snRNA m6Am的去甲基化酶。（編者註：事實上，關於FTO m6A去甲基化酶的爭論一直存在，從m6A到m6Am，從mRNA到snRNA，FTO的作用底物經歷了數次變革。

該研究在不依賴於m6A抗體的高通量測序方法MAZTER-seq的開發和建立的基礎上，對m6A位點和其參與的生命過程進行了分析，對基於m6A抗體依賴的測序方法得到的研究成果提出了新的思考。

值得注意的是，這兩篇文章幾乎同時發表，但各有側重。駱觀正組的m6A-REF-seq更多關注的是m6A修飾位點定性的準確性，闡釋了m6A-REF-seq擁有m6A定量的潛力，並探究了m6A修飾在物種間的保守性。而Schwartz組的MAZTER-seq在m6A定量方面做了很多工作，將m6A研究從定性領域推向定量領域。

然而，基於內切酶的m6A位點鑒定方法目前還存在限制。MazF酶只能識別ACA motif，而該motif只佔m6A經典DRACH motif的16%左右，所以無論是m6A-REF-seq還是MAZTER-seq尚不能覆蓋所有可能的m6A位點。

因此駱觀正組還對其他存在於細菌TA系統中的RNA內切酶進行了篩選，篩選出能夠識別UAC motif的ChpBK酶，說明細菌TA系統中的RNA內切酶可能都擁有識別m6A修飾的能力。同時也嘗試突變MazF的特定位點以擴大其識別的序列範圍，雖然突變的MazF酶對motif識別的結果並不理想，但是卻保留了其對m6A甲基化的識別能力，說明識別m6A甲基化的能力可能是這一類內切核酸酶所共有，未來通過定向進化或者其他篩選方式有望找到更符合經典DRACH motif或直接識別A和m6A的內切核酸酶。

但同時，方法的建立還是為了解決實際問題，m6A領域有太多的爭議，期待更完善的m6A位點鑒定方法的開發，讓我們更全面的審視m6A。

原文鏈接：

sciencedirect.com/scien；

advances.sciencemag.org

參考文獻

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