2018年蛋白质组亮点工作梳理|春季篇第一期
注：本文转载自公众号iProteome，原文作者为Spring老师
2018年蛋白质组亮点工作梳理|春季篇第一期
编者按：近年来，随著仪器性能和技术的进步，蛋白质组学领域已完成了量的积累而发展为质的突破，并在一定程度上催生了生命组学的大发展。在此背景下，2018年蛋白质组学在各个方面都获得了长足的进展。在过去的一年中，出现了哪些有意思的成果呢？从本期开始我们将推出「年末特刊」，同您一起回顾2018年度蛋白质组学工作，本特刊将分为春夏秋冬四辑，希望您能喜欢。
现在是北京时间2018年11月26日20点16分，我是大家的好朋友Spring，现在正被编辑催更。编辑准备在年末的时候搞出一个大新闻，咱们今儿就来聊一下本年度蛋白质组学方面的精选文章。事先声明一下，选择的文章均为个人观点，如果您有更好的文章推荐，欢迎留言交流；对于入选文章有所质疑，也仅代表本人才疏学浅、鉴赏水平有限，跳过便是。本期内容分为春夏秋冬四个专辑，好了废话不多说，下面让我们进入正题。
首先为大家带来的是一篇2018年1月发表于Cell上的文章，题为「A Map of Protein-Metabolite Interactions Reveals Principles of Chemical Communication」1。最近几年，化学蛋白质组学逐步升温，成为了研究小分子和蛋白质相互作用的有力工具。但是，已有的这些研究往往局限于有限种类的小分子或代谢物与特定蛋白质之间的相互作用，目前还缺少大规模研究小分子与蛋白质整体水平上的研究手段，即「组学」方法。（经典的introduction话语）在此项研究中，来自瑞士苏黎世联邦理工学院的Paola Picotti团队，发明了一种新的方法来发现细菌细胞中的蛋白和小的代谢分子之间之前未知的相互作用。首先提一下这位作者，想必在蛋白质组学领域，Picotti教授也是大家的熟人之一，对蛋白质构象变化，蛋白质组热稳定性和结构及化学蛋白质组学方面进行研究。早在2014年，其就在NBT上发表论文，构建了一种「限制性酶切」的方法（即Lip-SRM2，limited (or native) proteolysis-SRM），来研究蛋白质在复杂环境下的结构变化，本文同样利用了这个思路。
提到蛋白质，我们知道其一级结构为氨基酸的组成序列，直至形成高级的空间结构，而这些空间结构对于蛋白质行使功能，与其他分子的相互作用是至关重要的。而与其他的分子，无论是生物大分子或者是无机小分子等相结合，其空间结构会发生一定变化。这种分子间的结合和空间构象的变化往往会造成该段氨基酸序列被「保护起来」。举个简单的例子，使用DNA足迹法来研究DNA-蛋白质相互作用，就是使用的这个原理，只不过被「保护起来」的是DNA而已（Fig.2）。
在本研究中，通过升级Lip-SRM工作流LiP-SMap，可以进行大规模的鉴定蛋白质与代谢物相互作用。该方法同样使用了「限制性酶切」的手段，通过在非变形条件下加入与蛋白质相互作用的小分子，占据了作用靶标的肽段后，使用蛋白酶（常用的为蛋白酶K）进行有限时间的酶切，就能得到不同酶切产物肽段。由于受到小分子结合的保护，在实验组中，会产生所谓的「构象肽段」，其在切割时对蛋白质的构象具有特异性。接下来再使用常规的变性条件下酶切，产生完整的蛋白质组学鉴定信息。这样就可以获知与该小分子结合的蛋白质信息（Fig.3）。
方法建立后，需要对方法进行一定的评估。评估手段无非是使用一些已知代谢物进行试验，验证是否能鉴定出与这些代谢物相互作用的蛋白质等，在此不做赘述。除了可以进行对代谢物小分子的研究外，该方法还可以测定药物分子与蛋白的相互作用（其实原理一样）。之后他们以这种方式在大肠杆菌中测试了20种不同的代谢物以及它们与蛋白之间的相互作用，这些代谢物主要是经典碳代谢的中间产物，涵盖了氨基酸，有机酸，糖磷酸盐（如G6P）及核苷磷酸盐（如ATP）等。最终得到了大约1678种不同的蛋白-代谢物相互作用，其中超过1400种相互作用是是之前未知的。
通过比对BRENDA资料库中已知的代谢物-蛋白相互作用，研究人员对这些结果进行了FDR评估，最终的FDR约为5.5%，当然，他们也强调了，这种FDR的估算方法会使计算所得的FDR偏高。另外，研究人员还通过对文献调研信息、PDB资料库（Protein Data Bank Ligand Expo）计算小分子与其结合肽段的最小距离等方式，对所得到的结果进行打分评估，使结果更加可信。
既然发现了这么多新的结合蛋白，那么接下来就要研究这些结合是否会发挥功能了。大致将这些结合事件分为三类，作为催化底物（或竞争性抑制）、影响分子构象和影响蛋白复合体装配。
通过检测酶活，证实了柠檬酸盐对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Ppc）具有强烈的抑制作用；1,6二磷酸果糖（FBP）在浓度高于1nM的情况下，对G6PDH有活性调节的作用。催化调节方面，首先通过计算结合肽段在酶类蛋白质中的位置距离，进行酶促中心的比对，证实了一大部分结合位点均距离酶促反应中心距离较近。之后进行的实验表明，Citrate、PEP和GTP为PfkB的竞争性抑制剂；而6-磷酸果糖和GTP是PfkB的另外一组底物，这些实验表明，PfkB的「专一性」似乎不那么好（Fig.4）。
另外在影响蛋白复合物装配和解离的方面，利用Size-exclusion chromatography（尺寸排阻色谱）与质谱联用，可以清晰地观测到，通过加入ATP等小分子，会影响蛋白质复合体的装配，对蛋白酶解产生抵抗等（Fig.5）。
这篇文章就为大家介绍到这里，其中很多细节并没有完全展示，还是推荐大家去阅读文章原文，虽说到现在才看到这篇文章的同学需要受到批评（指蛋白质组领域的同学）。另外，1月份在Cell Chemical Biology上也发表了一篇有关化学蛋白质组学的文章，不过是通过化学蛋白质组学，利用crosslink与SILAC来研究蛋白质间相互作用的，题为「A Chemical Proteomics Approach to Reveal Direct Protein-Protein Interactions in Living Cells」3有兴趣的同学也可以看看。
看完了第一篇比较复杂难懂的文章，让我们转换一下心情，看一篇比较简单的方法学文章，由Simone Lemeer教授和Albert J R Heck教授2018年1月发表在Nature Methods上的短文（Brief Communications），题为「Widespread bacterial protein histidine phosphorylation revealed by mass spectrometry-based proteomics」4。
众所周知，可逆的磷酸化修饰在细胞的信号传导调控等方面起到了至关重要的作用，而目前的对于磷酸化修饰的研究，主要集中在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸上。虽然在组氨酸（Histone）上也可以发生磷酸化修饰，并发现这种修饰参与了细菌等生物体的信号转到和代谢方面，但是其作用功能和丰度方面的研究仍有很大的空缺，主要原因是缺乏大规模鉴定的工具。
对于组氨酸磷酸化修饰的鉴定，困难之处主要在于与通常的O-磷酸化相比，磷酸组氨酸上的氨基磷脂键相对不稳定，并且在酸性条件下容易水解。因此，常用的磷酸化富集方法如IMAC和MOAC等在较强酸性条件下工作的体系，理论上对于磷酸组氨酸的鉴定较为不利。
但是，研究人员利用合成的磷酸组氨酸标准品，进行了一系列酸性条件测试，结果发现在较为温和的酸性条件下（pH=2.3），磷酸组氨酸并不会发生大规模的降解。并且，之前也有研究报道，IMAC富集磷酸化肽段时，并非一定需要强酸性环境才具有较高的富集效率。
有了这些数据，研究人员就萌生了试一试的想法。结果可想而知，鉴定到了超过200个组氨酸上的磷酸化位点（Fig.6）。当然，对于方法他们也进行了一定的优化，并且需要满足一些特定的样品处理条件。之后的结果在此无需赘述，都是一些大家能够想到的数据。
所以说，各位同学，尽管大胆尝试吧，不需要墨守成规，万一就成功了呢？
作者：Spring
编辑：张俏
参考文献：
- Piazza, I. et al. A Map of Protein-Metabolite Interactions Reveals Principles of Chemical Communication. Cell 172, 358-372 e323, doi:10.1016/j.cell.2017.12.006 (2018).
- Feng, Y. et al. Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Nat Biotechnol 32, 1036-1044, doi:10.1038/nbt.2999 (2014).
- Kleiner, R. E., Hang, L. E., Molloy, K. R., Chait, B. T. & Kapoor, T. M. A Chemical Proteomics Approach to Reveal Direct Protein-Protein Interactions in Living Cells. Cell Chem Biol 25, 110-120 e113, doi:10.1016/j.chembiol.2017.10.001 (2018).
- Potel, C. M., Lin, M. H., Heck, A. J. R. & Lemeer, S. Widespread bacterial protein histidine phosphorylation revealed by mass spectrometry-based proteomics. Nat Methods 15, 187-190, doi:10.1038/nmeth.4580 (2018).
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