2018年蛋白質組亮點工作梳理|春季篇第一期
註：本文轉載自公眾號iProteome，原文作者為Spring老師
2018年蛋白質組亮點工作梳理|春季篇第一期
編者按：近年來，隨著儀器性能和技術的進步，蛋白質組學領域已完成了量的積累而發展為質的突破，並在一定程度上催生了生命組學的大發展。在此背景下，2018年蛋白質組學在各個方面都獲得了長足的進展。在過去的一年中，出現了哪些有意思的成果呢？從本期開始我們將推出「年末特刊」，同您一起回顧2018年度蛋白質組學工作，本特刊將分為春夏秋冬四輯，希望您能喜歡。
現在是北京時間2018年11月26日20點16分，我是大家的好朋友Spring，現在正被編輯催更。編輯準備在年末的時候搞出一個大新聞，咱們今兒就來聊一下本年度蛋白質組學方面的精選文章。事先聲明一下，選擇的文章均為個人觀點，如果您有更好的文章推薦，歡迎留言交流；對於入選文章有所質疑，也僅代表本人才疏學淺、鑒賞水平有限，跳過便是。本期內容分為春夏秋冬四個專輯，好了廢話不多說，下面讓我們進入正題。
首先為大家帶來的是一篇2018年1月發表於Cell上的文章，題為「A Map of Protein-Metabolite Interactions Reveals Principles of Chemical Communication」1。最近幾年，化學蛋白質組學逐步升溫，成為了研究小分子和蛋白質相互作用的有力工具。但是，已有的這些研究往往侷限於有限種類的小分子或代謝物與特定蛋白質之間的相互作用，目前還缺少大規模研究小分子與蛋白質整體水平上的研究手段，即「組學」方法。（經典的introduction話語）在此項研究中，來自瑞士蘇黎世聯邦理工學院的Paola Picotti團隊，發明瞭一種新的方法來發現細菌細胞中的蛋白和小的代謝分子之間之前未知的相互作用。首先提一下這位作者，想必在蛋白質組學領域，Picotti教授也是大家的熟人之一，對蛋白質構象變化，蛋白質組熱穩定性和結構及化學蛋白質組學方面進行研究。早在2014年，其就在NBT上發表論文，構建了一種「限制性酶切」的方法（即Lip-SRM2，limited (or native) proteolysis-SRM），來研究蛋白質在複雜環境下的結構變化，本文同樣利用了這個思路。
提到蛋白質，我們知道其一級結構為氨基酸的組成序列，直至形成高級的空間結構，而這些空間結構對於蛋白質行使功能，與其他分子的相互作用是至關重要的。而與其他的分子，無論是生物大分子或者是無機小分子等相結合，其空間結構會發生一定變化。這種分子間的結合和空間構象的變化往往會造成該段氨基酸序列被「保護起來」。舉個簡單的例子，使用DNA足跡法來研究DNA-蛋白質相互作用，就是使用的這個原理，只不過被「保護起來」的是DNA而已（Fig.2）。
在本研究中，通過升級Lip-SRM工作流LiP-SMap，可以進行大規模的鑒定蛋白質與代謝物相互作用。該方法同樣使用了「限制性酶切」的手段，通過在非變形條件下加入與蛋白質相互作用的小分子，佔據了作用靶標的肽段後，使用蛋白酶（常用的為蛋白酶K）進行有限時間的酶切，就能得到不同酶切產物肽段。由於受到小分子結合的保護，在實驗組中，會產生所謂的「構象肽段」，其在切割時對蛋白質的構象具有特異性。接下來再使用常規的變性條件下酶切，產生完整的蛋白質組學鑒定信息。這樣就可以獲知與該小分子結合的蛋白質信息（Fig.3）。
方法建立後，需要對方法進行一定的評估。評估手段無非是使用一些已知代謝物進行試驗，驗證是否能鑒定出與這些代謝物相互作用的蛋白質等，在此不做贅述。除了可以進行對代謝物小分子的研究外，該方法還可以測定藥物分子與蛋白的相互作用（其實原理一樣）。之後他們以這種方式在大腸桿菌中測試了20種不同的代謝物以及它們與蛋白之間的相互作用，這些代謝物主要是經典碳代謝的中間產物，涵蓋了氨基酸，有機酸，糖磷酸鹽（如G6P）及核苷磷酸鹽（如ATP）等。最終得到了大約1678種不同的蛋白-代謝物相互作用，其中超過1400種相互作用是是之前未知的。
通過比對BRENDA資料庫中已知的代謝物-蛋白相互作用，研究人員對這些結果進行了FDR評估，最終的FDR約為5.5%，當然，他們也強調了，這種FDR的估算方法會使計算所得的FDR偏高。另外，研究人員還通過對文獻調研信息、PDB資料庫（Protein Data Bank Ligand Expo）計算小分子與其結合肽段的最小距離等方式，對所得到的結果進行打分評估，使結果更加可信。
既然發現了這麼多新的結合蛋白，那麼接下來就要研究這些結合是否會發揮功能了。大致將這些結合事件分為三類，作為催化底物（或競爭性抑制）、影響分子構象和影響蛋白複合體裝配。
通過檢測酶活，證實了檸檬酸鹽對磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Ppc）具有強烈的抑制作用；1,6二磷酸果糖（FBP）在濃度高於1nM的情況下，對G6PDH有活性調節的作用。催化調節方面，首先通過計算結合肽段在酶類蛋白質中的位置距離，進行酶促中心的比對，證實了一大部分結合位點均距離酶促反應中心距離較近。之後進行的實驗表明，Citrate、PEP和GTP為PfkB的競爭性抑製劑；而6-磷酸果糖和GTP是PfkB的另外一組底物，這些實驗表明，PfkB的「專一性」似乎不那麼好（Fig.4）。
另外在影響蛋白複合物裝配和解離的方面，利用Size-exclusion chromatography（尺寸排阻色譜）與質譜聯用，可以清晰地觀測到，通過加入ATP等小分子，會影響蛋白質複合體的裝配，對蛋白酶解產生抵抗等（Fig.5）。
這篇文章就為大家介紹到這裡，其中很多細節並沒有完全展示，還是推薦大家去閱讀文章原文，雖說到現在纔看到這篇文章的同學需要受到批評（指蛋白質組領域的同學）。另外，1月份在Cell Chemical Biology上也發表了一篇有關化學蛋白質組學的文章，不過是通過化學蛋白質組學，利用crosslink與SILAC來研究蛋白質間相互作用的，題為「A Chemical Proteomics Approach to Reveal Direct Protein-Protein Interactions in Living Cells」3有興趣的同學也可以看看。
看完了第一篇比較複雜難懂的文章，讓我們轉換一下心情，看一篇比較簡單的方法學文章，由Simone Lemeer教授和Albert J R Heck教授2018年1月發表在Nature Methods上的短文（Brief Communications），題為「Widespread bacterial protein histidine phosphorylation revealed by mass spectrometry-based proteomics」4。
眾所周知，可逆的磷酸化修飾在細胞的信號傳導調控等方面起到了至關重要的作用，而目前的對於磷酸化修飾的研究，主要集中在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上。雖然在組氨酸（Histone）上也可以發生磷酸化修飾，並發現這種修飾參與了細菌等生物體的信號轉到和代謝方面，但是其作用功能和豐度方面的研究仍有很大的空缺，主要原因是缺乏大規模鑒定的工具。
對於組氨酸磷酸化修飾的鑒定，困難之處主要在於與通常的O-磷酸化相比，磷酸組氨酸上的氨基磷脂鍵相對不穩定，並且在酸性條件下容易水解。因此，常用的磷酸化富集方法如IMAC和MOAC等在較強酸性條件下工作的體系，理論上對於磷酸組氨酸的鑒定較為不利。
但是，研究人員利用合成的磷酸組氨酸標準品，進行了一系列酸性條件測試，結果發現在較為溫和的酸性條件下（pH=2.3），磷酸組氨酸並不會發生大規模的降解。並且，之前也有研究報道，IMAC富集磷酸化肽段時，並非一定需要強酸性環境才具有較高的富集效率。
有了這些數據，研究人員就萌生了試一試的想法。結果可想而知，鑒定到了超過200個組氨酸上的磷酸化位點（Fig.6）。當然，對於方法他們也進行了一定的優化，並且需要滿足一些特定的樣品處理條件。之後的結果在此無需贅述，都是一些大家能夠想到的數據。
所以說，各位同學，儘管大膽嘗試吧，不需要墨守成規，萬一就成功了呢？
作者：Spring
編輯：張俏
參考文獻：
- Piazza, I. et al. A Map of Protein-Metabolite Interactions Reveals Principles of Chemical Communication. Cell 172, 358-372 e323, doi:10.1016/j.cell.2017.12.006 (2018).
- Feng, Y. et al. Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Nat Biotechnol 32, 1036-1044, doi:10.1038/nbt.2999 (2014).
- Kleiner, R. E., Hang, L. E., Molloy, K. R., Chait, B. T. & Kapoor, T. M. A Chemical Proteomics Approach to Reveal Direct Protein-Protein Interactions in Living Cells. Cell Chem Biol 25, 110-120 e113, doi:10.1016/j.chembiol.2017.10.001 (2018).
- Potel, C. M., Lin, M. H., Heck, A. J. R. & Lemeer, S. Widespread bacterial protein histidine phosphorylation revealed by mass spectrometry-based proteomics. Nat Methods 15, 187-190, doi:10.1038/nmeth.4580 (2018).
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