2018年蛋白质组亮点工作梳理|夏季篇
注：本文转载自公众号iProteome，原文作者为Spring老师
2018年蛋白质组亮点工作梳理|夏季篇
导语：朋友们，大家好。最近很多人问小编为什么春季篇之后Spring老师就沉默了，难道春季以后蛋白质组没有新的进展？当然不是。我们蓬勃发展的蛋白质组领域正以迅雷不及掩耳之势开疆扩土，好文章也是层出不穷。今天我们就给大家带来蛋白质组学亮点工作之夏季篇，话不多说，有请我们今天的嘉宾Spring老师，大家掌声欢迎。
现在是北京时间2018年12月5日21点51分，我是大家的好朋友Spring。话说上一期咱们聊了聊Spring，现在也该轮到Summer了。在编辑的催更下，总算是踉踉跄跄地和大家聊聊2018年炎热的夏天，蛋白质组学领域又有哪些文章值得一看呢？依照惯例，入选的文章仅仅是我一个人阅读和挑选的，再者本人水平和鉴赏能力实在有限，和大家聊聊这些文章也算是抛砖引玉，毕竟阅读文献这个事，还是要自己上心是不？单凭几篇公众号和标题党（当然这个文章也算在内），「姿势水平」是无法提高的。
好了，言归正传，咱们就开始进入正题。
下面插播一条简讯，「MaxQuant goes Linux」 1。MaxQuant作为蛋白质组学最常用的几款软体之一，造福了千千万万的蛋白质组学研究人员。最初MaxQuant开发时，使用的是Windows平台，所以后续版本也就沿用至今，但是最近Linux系统逐渐在市场上占据一席之地后，MaxQuant也顺势推出了Linux版本。「不那么令人惊讶的是」，MaxQuant在Linux系统上的性能要更加优秀。（Fig.1）
本条简讯以Correspondence的形式，由Juergen Cox组发表于2018年5月的Nature Methods。
让我们继续看下去。如果说春季文章中，方法学文章占据主流，那么夏季文章中，总结起来就是「方法学文章再接再厉，PTM大放异彩」。
在基于质谱的蛋白质组学领域，追求「deep coverage」是研究人员们不懈奋斗的目标。从最初的通过加长液相梯度和多级分馏，「以时间换深度」，到使用高效的蛋白提取和富集方法，再到如今由于仪器性能等的不断改善，「打一针」成为主流，覆盖深度这个目标一直没有变过。但是，除了使用极为复杂和耗时的多级分馏加长梯度组合外，较短梯度内实现一次质谱检测鉴定10,000个蛋白似乎是个难以逾越的鸿沟（MBR这种取巧犯规的排除在外）。造成这一点的一个重要原因是，高丰度肽段会「掩盖」掉其他低丰度肽段的信号，使之检测变得极为困难。
不过，在2018年5月发表在Nature Methods上的文章「BoxCar acquisition method enables single-shot proteomics at a depth of 10,000 proteins in 100 minutes」2，通过改进质谱采集方式，终于实现了这一目标。文章作者想必我也不用过多介绍，来自德国的Matthias Mann教授。在这篇文章之前，要先简要聊聊目前shotgun proteome质谱检测的工作流程，方便同学们更好的理解这篇文章（精于质谱的同学直接忽略掉即可）。
我们都知道，肽段通过ESI源离子化后进入质谱，未经四极杆隔离在Orbitrap中进行扫描，称之为全扫描（FullScan）。在进入Orbitrap前，离子需要在配套的C-trap中冷却富集驻留一段时间，才会进入扫描。（Fig.2）这段时间，称之为离子注入时间（Ion injection time，IT），通过这个参数和与之对应的C-Trap贮存能力（AGC），来调整进入扫描的离子数量。之后再根据全扫描得到的结果，根据某些筛选条件（最常见的为TopN），由四级杆隔离出某些母离子进行碎裂，碎片离子再重复进行上述的扫描。而在这个过程中呢，混合的肽段是源源不断的从ESI源离子化进入质谱中的，不过通过质谱中各种部件的开关来控制这些肽段离子是否进入后续的检测元件中。举个例子来说，这个过程就好像你打开了水龙头，管道里面是自来水、可乐、咖啡和绿茶的混合液体（味道肯定很奇怪），无论是是否用杯子去接这些液体，水龙头的水是不会停下的。
刚刚也有提到，限制检测深度的主要是由一些高丰度的离子引起的。这是因为，在贮存离子的C-Trap中，空间是有限的，同一时间进入的混合离子中，高丰度离子占据了绝大多数，留给其他离子的检测机会自然而然就少了（一个小问题，目前C-Trap能贮存多少ions？）。虽然有「动态排除」的采样机制存在，提升了检测效率，但也是「治标不治本」（同学们同样可以思考一下）。
最近几年流行的「DIA」方法，一定程度上给了我们启发。DIA采样方式将FullScan拆分成一个个独立的「窗口」，再将这些窗口内的肽段分别进行二级碎裂扫描，在子离子的层面上进行定量，就能一定程度上排除一级定量中存在的干扰情况。（Fig.3）
不知道是否是受到「DIA」采样方式的启发，这篇文章的研究人员也采用了同样的策略，不过是直接应用到FullScan的采集中。同样的，将一级扫描通过四极杆分为相隔的不同窗口，每个窗口独立的分配最大离子注入时间和最大的AGC，这样就能使高丰度离子的「掩盖」仅仅发生在其所在的一个窗口单元中，而不会影响其他较低丰度的离子。之后这些离子在C-Trap中贮存，达到设定的数目后，进入Orbitrap进行扫描。（Fig.4）这样就能极大的提高低丰度肽段离子的信噪比，进而增加鉴定数目。简单来说一句话，让丰度高的离子少进来点，让丰度低的离子多进来点。
聪明的同学可能就要问了，这个办法在定性鉴定上十分有效，但是在定量上呢？人为的干预检测到肽段的比例，就如同刚刚举得例子，我这水龙头明明出来的是一杯牛奶，你这种方法就是在牛奶里面强行掺水了。当然，研究人员也一定程度上解决了这个问题。在每一轮BoxCar扫描之前，均加入了一次常规的FullScan，通过将BoxCar扫描得到的谱图，对应到Full Scan谱图中去，即能得到每个离子m/z的传输效率，再计算其对应比例，得到传输效率系数（transmission factors），来进一步计算原本离子的丰度。（Fig.5）
在文章中关于定量方面的描述语焉不详，个人感觉类似于match between run的做法，虽然在后续的定量验证实验中，研究人员给出了较好的结果（Fig.6），但是个人认为这个定量问题仍然没有完美解决。这个问题就仁者见仁智者见智了。
后续的工作均为对该方法的验证，同样是常规的套路，也就不做过多说明了。值得一提的是，使用BoxCar的方法，在100min的梯度内，实现了小鼠脑组织中10,000个蛋白的深度覆盖，也算是呼应标题了。
在蛋白质组学定量的研究中，有标定量和无标定量孰优孰劣一直争论不断，既然上文中的方法主要采用的是label-free方式，下面我们就再简单聊一聊一篇开发新型标记试剂的研究。
这篇文章同样来自于Felix Meissner 团队和Mann团队（同学们不要烦，后面还有他），于2018年6月发表于Nature Methods，题为「EASI-tag enables accurate multiplexed and interference-free MS2-based proteome quantification」3。目前主流的标记技术包括iTRAQ和TMT等，这些试剂的原理均为在二级肽段碎裂时，产生相应的报告离子用于定量。这种方法最主要的缺陷是无法确定产生的报告离子确实来源于对应的标记肽段，即在隔离母离子的时候在隔离窗口内，无可避免地会出现「共隔离」离子的干扰（绝大部分基于质谱的蛋白质组学问题均来源于此），即在肽段碎裂的同时，释放出的报告离子会产生互相的干扰。另外也会产生「比例压缩」现象，导致定量比例无法准确反映蛋白变化的实际情况。（同学们也可以思考为什么会有这种现象）
为了解决这个问题，研究人员尝试了各种各样的方法，例如使用较窄的隔离窗口，后期数据校正和三级定量等方式。其中有一种方法，利用了肽段碎裂过程中，产生报告离子的同时，也会产生一部分未完全碎裂的「肽段+标记残基」离子，由于平衡基团的存在，剩余标记残基的质量数并不相同，且于报告离子一一对应，根据这些离子就能确定报告离子是由哪些肽段所产生。
本篇文章受到这种思路，加之最近流行的MS-cleavable交联试剂（例如DSSO）等的启发，开发出了一种新型的标记试剂，命名为「easily abstractable sulfoxide-based isobaric-tag，EASI-tag」。（Fig.7）这种试剂具有区别于DSSO等可断裂式交联试剂的非对称结构，能在较低的碎裂能量情况下进行断裂，产生中性丢失而保留整个的肽段骨架和标记试剂残基，这样就能形成肽段偶联报告离子（peptide-coupled reporters）进行定量。由于这个过程在较低的CE能量下完成，可以极大的提高肽段偶联报告离子的产生效率，再进行常规的碎裂过程鉴定肽段碎片离子。（Fig.8）
除此之外，我们知道自然界中存在的天然同位素13C等，会导致肽段离子以「同位素峰」簇的形式出现，每个同位素峰相差约为1Da。那么为题就来了，在隔离离子的时候，经常会共隔离这些同位素峰造成干扰，尤其是使用了同位素标记试剂的时候。所以，为了隔离12C的同位素峰，本篇文章使用的不对称隔离窗口，不仅降低到了0.4 Th，而且加入了-0.15 Th的偏移，令干扰效果进一步降低。（Fig.9，图中肽段丰度为10:3:1:1:3:10，EASI-tag试剂6标）
后续又是进行新标记方法的验证实验，采用了经典的「two proteome」实验，以HeLa细胞蛋白质组作为背景，以不同比例掺入标记的酵母肽段，进行定量验证，同样不做赘述。不过值得注意的一点是，「ratio compression」现象具有一定程度的改善。（Fig.10）
这项研究呢，通过借鉴之前其他人的研究思路和现有交联试剂的特征，开发出了一种新型的标记试剂，具体的应用效果暂且不论（Spring持消极态度，希望打脸），但是充分体现了科研中举一反三的重要作用，那么没有研究思路的同学们，是不是文献啃的少了呢？
在上一期的春季篇中，介绍了一种研究小分子和蛋白质相互作用的Lip-SRM的方法，小伙伴们不知是否还有印象？通过小分子结合来保护酶切位点，是一种经典的化学蛋白质组学研究方式，接下来的文章呢，我们来聊一聊另一种「保护」措施，热稳定。
加热会使蛋白质变性，变性的蛋白质在溶液中会沉降，这个道理大家都懂，而蛋白质一旦与其他分子相结合，大多数情况下其稳定性会增加。根据这个原理，利用定量质谱测定不同温度下的可溶蛋白质，就能得到其「熔化曲线」，进而就能判断是否有蛋白质与其他分子之间的相互作用了。来自新加坡的Nordlund教授研究团队，早在2013年就在Science上发表文章，建立了应用于活细胞的蛋白质热稳定检测方法cellular thermal shift assay (CETSA)4，来研究药物与蛋白质的相互作用，而在今年的5月，他们又进一步发展了CETSA手段，在Cell杂志上发表题为「Modulation of Protein-Interaction States through the Cell Cycle」5的研究。
首先使用化学阻滞和离心淘洗两种不同的方式获得了处于不同细胞周期的细胞，之后进行了2D-CETSA的实验，即在37℃的条件下测定不同细胞周期时的蛋白质丰度变化，以及不同热激条件下不同细胞周期时的蛋白质热稳定性（Fig.11）。这样就能将细胞周期过程中的蛋白质分为四类：NN，无变化；CN，仅在蛋白丰度上有变化；NC，仅在热稳定性上有变化；CC，在丰度和热稳定性上均有变化（Fig.12）。总体上看，研究人员共鉴定到了超过750个蛋白质在细胞周期过程中，具有显著的CETSA信号变化，也就是这些蛋白的相互作用状态有所改变。
既然有了这些数据，那么就可以对整个细胞周期中不同时段的状态变化进行描绘。举个例子，在整个过程中会发生许多代谢反应，例如一些酶在与其底物或调节分子结合时，就会影响其热稳定性，在CETSA实验中，胸苷酸合成酶（TYMS）、核苷酸还原酶（RNR）和胸苷酸激酶（DTYMK）等的变化均被成功检测。再比如，细胞周期关键的调控机制，CDKs和Cyclin的相互作用调控，也在实验数据中有所体现。（Fig.13）另外，研究人员也探究了几个细胞周期时相（S期、前中期和G2期）中特定的相互作用状态。不过这些数据大多数是对之前已知的蛋白相互作用和复合体进行了确证，在此就不做过多介绍了，有兴趣的同学还请阅读原文。
最后，研究人员比较了这些不同细胞周期时段的蛋白相互作用状态，发现鉴定到的发生变化的蛋白质相互作用主要发生于S期和有丝分裂期。而G1期和G2期中，蛋白质相互作用的状态是十分类似的，这与之前我们对细胞周期的认识具有一定的差异。在G1期，细胞会不断合成物质进行DNA复制的准备，而经历了S期的DNA复制后，G2期主要负责对复制的DNA进行检查和进行分裂准备，按照功能上来说，G1期和G2期的生命活动差异较大，并且在细胞形态学上，二者也完全不同。不过在CETSA实验为我们提供的蛋白质相互作用状态的层面上，两个时期是非常接近的，这也让我们有机会从另一个角度来理解和研究细胞周期这个复杂的生命活动。
当然，作为一篇能发表在Cell上的文章，其中包含的数据和细节肯定不是能在这里用三言两语解释清楚的，无论感不感兴趣，同学们还是应该认真研读的。多说一句，这篇文章发表之初，也有一些「媒体」称之为「改写教科书」或者「颠覆常规」等，这些抓人眼球的词语在各种文献解读的文章中频频出现，也不知道教科书更改的速度赶不赶得上文章发表的速度，至于这些到底是真正的突破还是所谓的「标题党」，还希望大家心中有数。
好的，总结的前半句已经完毕，进入后半句，「PTM大放异彩」。蛋白质组学的优势之一就是能测定蛋白质的翻译后修饰（PTM），往往这些修饰对蛋白发挥功能至关重要，其中研究最为广泛的当属磷酸化蛋白质组学。下面要聊的几篇文章，均将磷酸化蛋白质组学作为主要的研究手段，我们进入正题。
2017年的炸药奖生理学或医学奖，颁发给了对昼夜节律做出卓越贡献的三位科学家。但是我们对昼夜节律的调控，以及你生命中大部分时间所从事的「事业」——睡眠，的认识还相当不足。作为同学们每天「吃饭睡觉打豆豆」的日常之一，饿了就要吃，困了就要睡，看起来是再自然不过，然而有没有深入地思考为什么会产生睡意？「睡意」这个抽象的感觉概念是如何受到生理调控的呢？
2018年6月，刘清华教授、Masashi Yanagisawa教授和Hiromasa Funato教授等三个课题组联合在Nature发表题为「Quantitative phosphoproteomic analysis of the molecular substrates of sleep need」6的文章，令我们对睡眠的认识，又向前迈进了一步。
不论是研究疾病还是正常的生理现象，构建模型都是最开始和重要的一步。但是要构建睡眠相关，尤其是嗜睡这种自发行为的动物模型，就是非常困难的了。好在之前Masashi Yanagisawa教授课题组利用正向遗传筛选技术，成功构建了Sleepy嗜睡小鼠模型（H. Funato et al., Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice7. Nature 539, 378）。（刘清华教授为作者之一）
在本文的研究中，作者使用了行为模型：睡眠6小时组、剥夺睡眠6小时组和剥夺睡眠6小时后补充睡眠3小时组，以及上文提到的遗传模型，Sleepy和WT组在刚刚进入清醒状态时，各自取全脑组织，使用TMT标记的方法对其蛋白质组和磷酸化蛋白质组进行分析。（Fig.14）
通过分析发现，对比各组实验，在丰度上变化的蛋白质极少，而在磷酸化的水平上变化十分剧烈，在Sleepy小鼠中大量蛋白的磷酸化水平升高，预示著磷酸化调控在睡眠过程中起到重要作用。（Fig.15）当然了，变化的虽然多，但是还是要有主次之分。研究人员发现，Sleepy组和睡眠剥夺组（SD6）中，有一些具有多磷酸化位点的蛋白，具有相似的变化模式，所以研究人员使用了「phosphorylation state change (?Ps) analysis」这一方法，即将同一蛋白质上的磷酸化位点变化程度进行加和，得出整体上磷酸化变化最大的蛋白，认为这些蛋白有可能是睡眠调控过程中最为重要的蛋白群体之一。最终，研究人员发现了80个磷酸化程度变化最大的蛋白质，并命名为「Sleep-Need-Index-PhosphoProteins (SNIPPs)」，有趣的是，其中的69个为神经突触结构蛋白。之后又对SNIPPs磷酸化是随著时间积累进行了验证，再次略过。
细心的同学可能已经发现，Sleepy小鼠明明是嗜睡模型，其睡眠时间长的离谱，但是磷酸化水平为何升高，出现了相反的结论呢？进一步通过蛋白相互作用组学的研究表明，由于Sik3突变而构建的Sleepy小鼠中，SLEEPY蛋白（Sik3突变型）相比于正常的激酶SIK3，结合了其他几百种蛋白，其中还包括28个SNIPPs蛋白。（Fig.16）这样就解释的通了，SLEEPY通过磷酸化其他SNIPPs，产生了持续的睡意刺激大脑。那么同学们想想，接下来的实验你要怎么做呢？
提到激酶，肯定是想到抑制剂嘛！使用Sik3的抑制剂，同样可以抑制SLEEPY的激酶活性。使用抑制剂处理Sleepy小鼠和睡眠剥夺小鼠后，发现其SNIPPs的磷酸化程度下降，并且睡眠需求相关的生理指标也产生了降低。这些都说明，蛋白磷酸化，尤其是SNIPPs的磷酸化水平，在睡眠调控稳态中起到非常重要的作用。（Fig.17）
除了本篇文章所研究的睡眠稳态系统外，昼夜节律时钟也是睡眠调控的重要方面。2018年4月丁琛课题组发表在Nature Communications上题为「A proteomics landscape of circadian clock in mouse liver」8的文章，系统地揭示了以转录因子DNA结合活性为中心，多维蛋白质组学分层调控肝脏节律，也推荐大家去看一看，在此也不做过多介绍。
好了，进入下一篇文章。上篇文章使用了遗传学方法来构建生理性模型，使用药物或者其他外界条件刺激构建的刺激-响应模型也是常用的研究对象之一。2018年6月，Christoph Schwarzer 教授和Matthias Mann教授团队，在Science上发表题为「In vivo brain GPCR signaling elucidated by phosphoproteomics」9的文章，是非常经典的蛋白质组学研究，十分推荐同学们去仔细研读。
言归正传，在对抗各种疾病中，人类发现或开发出的各种药物是最强有力的手段之一。而在各种药物的靶点中，GPCRs是其中最大的一类（A comprehensive map of molecular drug targets）。（Fig.18）其中针对阿片受体（KOR，GPCR的一种）的阿片类药物，是广泛应用且效果十分有效的镇痛类药物之一。除了良好的镇痛效果外，阿片类药物的副作用也十分明显，例如恶心呕吐、焦虑和药物成瘾依赖等。针对产生副作用这一问题，研究人员尝试使用磷酸化蛋白质组学的方法来探讨其中的分子机制。
阿片受体在神经系统中广泛分布但是分布并不均匀，所以本篇研究将鼠脑分为5个不同区域来研究。（Region-resolved和Cell-type-resolved蛋白质组学是近来的热点和发展趋势之一）通过脑内给药的方式，共测定了5种KOR激动剂刺激后，鼠脑中磷酸化蛋白质组学的变化，共计鉴定到了50000多个磷酸化位点。其中，激动剂U-50,488H处理后，磷酸化位点变化最大，刺激5分钟后纹状体中有超过1000个磷酸化位点发生变化。（Fig.19）
可以明显的看到，大脑不同区域对KOR激动剂的刺激，呈现出极为不同的磷酸化修饰反应。此外，不仅各个区域的磷酸化修饰会变化，随著刺激时间推移，磷酸化修饰也会发生变化。（Fig.20）
针对这些出现变化的磷酸化蛋白，研究人员发现其主要集中于突触部分，所以接下来探究了这些KOR激动剂处理后，对突触的信号通路会产生哪些影响。（Fig.21）U-50,488H刺激后5分钟后，纹状体突触蛋白的磷酸化水平大幅度降低，从而猜测是否是由于激活了磷酸酶系统去除了一部分的磷酸化修饰。
那么如何验证这个猜想呢？就如同上一篇文章一样，同样是使用抑制剂的策略。研究人员预先使用三种不同的磷酸酶抑制剂（Tauto、Fost、Caly）来处理小鼠后，再对小鼠给予U-50,488H刺激，结果发现突触蛋白大规模去磷酸化的现象消失（Fig.22），说明磷酸酶系统在突触的GPCR信号转导过程中，起到十分重要的作用。
说了这么多，那么引起阿片类药物副作用的原因到底是什么呢？通过对磷酸化差异信号通路的分析，研究人员发现在U-50,488H刺激5分钟后，纹状体内mTOR信号通路被显著激活。（Fig.23）无独有偶，之前的研究证实，mTOR信号通路在纹状体内的异常和抑郁等精神疾病有关，那么阿片类药物的副作用会不会是mTOR信号通路所导致的呢？依旧是老办法，使用mTOR的抑制剂后再使用U-50,488H处理，结果发现小鼠模型的延误副作用得到了明显改善，而主要的镇痛效果等并没有受到影响。（Fig.23）
文章的主要结果就和大家聊到这，再次强调文章中许多细节部分并没有一一展示，需要同学们去仔细阅读原文。并且，这又是一篇十分经典且模式化的蛋白质组学文章，从最开始的模型构建和实验数据展示，到寻找差异和锁定主要研究点，再到最后的功能验证解决提出的问题，虽然最后并没有深入到分子机制和功能的研究探讨，但是作为一篇组学文章，研究思路异常清晰和工整，各个部分已经近乎极致，是一篇不可多得的「模板化」文章，值得同学们反复钻研和学习。
上面的两篇文章均是使用磷酸化蛋白质组学为手段，即测定蛋白质磷酸化修饰的变化，造成这种修饰变化的激酶/磷酸酶也是研究的重点领域，下面我们就来聊一聊一篇针对激酶的研究，发表于Nature Chemical Biology上题为「Kinome rewiring reveals AURKA limits PI3K-pathway inhibitor efficacy in breast cancer」10的文章。
Breast cancer中经常出现PI3K-ATK-mTOR通路的异常，但是针对该通路的激酶抑制剂疗效却差异很大，耐药性的出现比比皆是。那么药物疗效不佳和耐药性是如何产生的？研究人员希望通过分析药物处理后，研究激酶的变化来回答这些问题。提到激酶的大规模富集研究，同学们会想到什么方法？
没错（假装听到了答案），目前最常用的就是由Kuster教授等开发的Kinobeads。熟悉的同学应该想到，2017年12月Kuster教授使用该方法在Science上刊文「The target landscape of clinical kinase drugs」11。本篇文章同样使用了类似的方法，不过稍加改进，针对type I kinase inhibitors，称之为「multiplexed inhibitor beads, MIBs」。为了能更好的代表整个乳腺癌，研究人员选取了遗传背景各不相同的5种乳腺癌细胞，和常用的4种抑制剂进行实验。（Fig.24）通过对比药物刺激后，sensitive和resistance细胞中激酶的活性程度，研究人员发现确定了一个候选激酶，有丝分裂激酶AURKA。（Fig.25）
既然已经确定了候选激酶，那么之后就是各种分子生物学的功能研究了。进一步通过WB验证，AURKA与PI3K和AKT的抑制剂药物抵抗性有关。（Fig.26）有了这条线索，研究人员又验证了联合用药，同时抑制PI3K通路和AURKA是否能起到更好的效果。并且，PI3K通路被抑制，主要会引起细胞生长抑制，而AURKA恰恰又是一个和细胞有丝分裂相关的激酶，自然而然地，就会测定二者联合抑制后细胞凋亡的情况。结果证实，联合用药确实会大大增强细胞凋亡的比例，二者具有协同效应。（Fig.27）
细胞实验搞定了，动物实验也不能少了。在体内二者是否还具有协同效应呢？结果一目了然，都不需要我再废话了。（Fig.28）
做到这里，已经算是个很完整的故事了。不过嘛，研究永无止境，继续探讨的问题是这种协同效应是如何产生的。先从PI3K通路的效应分子p-S6和p-4E-BP1找起。联合用药几乎使p-S6的活性完全消失，而另外的p-4E-BP1在单独使用RAD001抑制PI3K通路时，出现了明显的升高，说明通过反馈调节，PI3K-mTOR通路的抑制并不完全再度激活，而联合用药组，p-4E-BP1的水平则恢复到了正常值。（Fig.29）同时也发现，使用AURKA抑制剂MLN8237，居然会使AKT的磷酸化水平下降，之后的一系列实验也证实，AURKA通过保持AKT的活性产生了PI3K抑制剂的耐药性。（Fig.30）而联合用药则会改变促凋亡和抗凋亡蛋白BAX/BCL2的比例（此处未在本文中体现，请参阅原文），从而增强了药效。
接下来再进一步，在PI3K抑制剂处理后，是什么调控AURKA上调使得AKT保持活性呢？在前期的PI3K抑制剂BYL719处理细胞的数据中，发现大部分MYC的靶基因很多都出现了下调的情况，那么就将目光集中在MYC这个鼎鼎大名的蛋白上。在MYC过表达的细胞中，AURKA的表达量和磷酸化水平均出现了明显的上升。（Fig.31）已知MYC过表达会使细胞产生耐药性，而通过AURKA抑制剂MLN8237则能使细胞的耐药性回复到正常水平。（Fig.32）
针对于PI3K通路耐药性的闭环这样就完成了。（Fig.33）说起来和上一期的文章类似，这也是一篇组学领域典型的「第一张figure」文章，利用组学的手段找出候选基因，再使用分子生物学和细胞生物学等方式研究分子机制。想起来之前实验室一位教授说过，这种文章使用组学手段作为第一张figure，和我们组学文章最后一张figure要做「生物学」验证是一个道理。多个学科的融合，不同技术手段的碰撞，才能令我们的研究更加深入和全面，这也和目前「大数据」和组学使用全局看待问题的思路不谋而合。
好了，虽然意犹未尽，无奈时间篇幅均有限制，本期内容就到这里，我们又要说再见了。我是你们的好朋友Spring，青山不改，绿水长流，咱们后会有期，拜拜！
参考文献：
- Sinitcyn, P. et al. MaxQuant goes Linux. Nat Methods 15, 401, doi:10.1038/s41592-018-0018-y (2018).
- Meier, F., Geyer, P. E., Virreira Winter, S., Cox, J. & Mann, M. BoxCar acquisition method enables single-shot proteomics at a depth of 10,000 proteins in 100 minutes. Nat Methods 15, 440-448, doi:10.1038/s41592-018-0003-5 (2018).
- Virreira Winter, S. et al. EASI-tag enables accurate multiplexed and interference-free MS2-based proteome quantification. Nat Methods 15, 527-530, doi:10.1038/s41592-018-0037-8 (2018).
- Martinez Molina, D. et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science 341, 84-87, doi:10.1126/science.1233606 (2013).
- Dai, L. et al. Modulation of Protein-Interaction States through the Cell Cycle. Cell 173, 1481-1494 e1413, doi:10.1016/j.cell.2018.03.065 (2018).
- Wang, Z. et al. Quantitative phosphoproteomic analysis of the molecular substrates of sleep need. Nature 558, 435-439, doi:10.1038/s41586-018-0218-8 (2018).
- Funato, H. et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature 539, 378-383, doi:10.1038/nature20142 (2016).
- Wang, Y. et al. A proteomics landscape of circadian clock in mouse liver. Nat Commun9, 1553, doi:10.1038/s41467-018-03898-2 (2018).
- Liu, J. J. et al. In vivo brain GPCR signaling elucidated by phosphoproteomics. Science360, doi:10.1126/science.aao4927 (2018).Donnella, H. J. et al. Kinome rewiring reveals AURKA limits PI3K-pathway inhibitor efficacy in breast cancer. Nat Chem Biol 14, 768-777, doi:10.1038/s41589-018-0081-9 (2018).
- Klaeger, S. et al. The target landscape of clinical kinase drugs. Science 358, doi:10.1126/science.aan4368 (2017).
作者：Spring
编辑：张俏
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