2018年蛋白質組亮點工作梳理|夏季篇
註：本文轉載自公眾號iProteome，原文作者為Spring老師
2018年蛋白質組亮點工作梳理|夏季篇
導語：朋友們，大家好。最近很多人問小編為什麼春季篇之後Spring老師就沉默了，難道春季以後蛋白質組沒有新的進展？當然不是。我們蓬勃發展的蛋白質組領域正以迅雷不及掩耳之勢開疆擴土，好文章也是層出不窮。今天我們就給大家帶來蛋白質組學亮點工作之夏季篇，話不多說，有請我們今天的嘉賓Spring老師，大家掌聲歡迎。
現在是北京時間2018年12月5日21點51分，我是大家的好朋友Spring。話說上一期咱們聊了聊Spring，現在也該輪到Summer了。在編輯的催更下，總算是踉踉蹌蹌地和大家聊聊2018年炎熱的夏天，蛋白質組學領域又有哪些文章值得一看呢？依照慣例，入選的文章僅僅是我一個人閱讀和挑選的，再者本人水平和鑒賞能力實在有限，和大家聊聊這些文章也算是拋磚引玉，畢竟閱讀文獻這個事，還是要自己上心是不？單憑幾篇公眾號和標題黨（當然這個文章也算在內），「姿勢水平」是無法提高的。
好了，言歸正傳，咱們就開始進入正題。
下面插播一條簡訊，「MaxQuant goes Linux」 1。MaxQuant作為蛋白質組學最常用的幾款軟體之一，造福了千千萬萬的蛋白質組學研究人員。最初MaxQuant開發時，使用的是Windows平臺，所以後續版本也就沿用至今，但是最近Linux系統逐漸在市場上佔據一席之地後，MaxQuant也順勢推出了Linux版本。「不那麼令人驚訝的是」，MaxQuant在Linux系統上的性能要更加優秀。（Fig.1）
本條簡訊以Correspondence的形式，由Juergen Cox組發表於2018年5月的Nature Methods。
讓我們繼續看下去。如果說春季文章中，方法學文章佔據主流，那麼夏季文章中，總結起來就是「方法學文章再接再厲，PTM大放異彩」。
在基於質譜的蛋白質組學領域，追求「deep coverage」是研究人員們不懈奮鬥的目標。從最初的通過加長液相梯度和多級分餾，「以時間換深度」，到使用高效的蛋白提取和富集方法，再到如今由於儀器性能等的不斷改善，「打一針」成為主流，覆蓋深度這個目標一直沒有變過。但是，除了使用極為複雜和耗時的多級分餾加長梯度組合外，較短梯度內實現一次質譜檢測鑒定10,000個蛋白似乎是個難以逾越的鴻溝（MBR這種取巧犯規的排除在外）。造成這一點的一個重要原因是，高丰度肽段會「掩蓋」掉其他低丰度肽段的信號，使之檢測變得極為困難。
不過，在2018年5月發表在Nature Methods上的文章「BoxCar acquisition method enables single-shot proteomics at a depth of 10,000 proteins in 100 minutes」2，通過改進質譜採集方式，終於實現了這一目標。文章作者想必我也不用過多介紹，來自德國的Matthias Mann教授。在這篇文章之前，要先簡要聊聊目前shotgun proteome質譜檢測的工作流程，方便同學們更好的理解這篇文章（精於質譜的同學直接忽略掉即可）。
我們都知道，肽段通過ESI源離子化後進入質譜，未經四極桿隔離在Orbitrap中進行掃描，稱之為全掃描（FullScan）。在進入Orbitrap前，離子需要在配套的C-trap中冷卻富集駐留一段時間，才會進入掃描。（Fig.2）這段時間，稱之為離子注入時間（Ion injection time，IT），通過這個參數和與之對應的C-Trap貯存能力（AGC），來調整進入掃描的離子數量。之後再根據全掃描得到的結果，根據某些篩選條件（最常見的為TopN），由四級桿隔離出某些母離子進行碎裂，碎片離子再重複進行上述的掃描。而在這個過程中呢，混合的肽段是源源不斷的從ESI源離子化進入質譜中的，不過通過質譜中各種部件的開關來控制這些肽段離子是否進入後續的檢測元件中。舉個例子來說，這個過程就好像你打開了水龍頭，管道裡面是自來水、可樂、咖啡和綠茶的混合液體（味道肯定很奇怪），無論是是否用杯子去接這些液體，水龍頭的水是不會停下的。
剛剛也有提到，限制檢測深度的主要是由一些高丰度的離子引起的。這是因為，在貯存離子的C-Trap中，空間是有限的，同一時間進入的混合離子中，高丰度離子佔據了絕大多數，留給其他離子的檢測機會自然而然就少了（一個小問題，目前C-Trap能貯存多少ions？）。雖然有「動態排除」的採樣機制存在，提升了檢測效率，但也是「治標不治本」（同學們同樣可以思考一下）。
最近幾年流行的「DIA」方法，一定程度上給了我們啟發。DIA採樣方式將FullScan拆分成一個個獨立的「窗口」，再將這些窗口內的肽段分別進行二級碎裂掃描，在子離子的層面上進行定量，就能一定程度上排除一級定量中存在的幹擾情況。（Fig.3）
不知道是否是受到「DIA」採樣方式的啟發，這篇文章的研究人員也採用了同樣的策略，不過是直接應用到FullScan的採集中。同樣的，將一級掃描通過四極桿分為相隔的不同窗口，每個窗口獨立的分配最大離子注入時間和最大的AGC，這樣就能使高丰度離子的「掩蓋」僅僅發生在其所在的一個窗口單元中，而不會影響其他較低丰度的離子。之後這些離子在C-Trap中貯存，達到設定的數目後，進入Orbitrap進行掃描。（Fig.4）這樣就能極大的提高低丰度肽段離子的信噪比，進而增加鑒定數目。簡單來說一句話，讓丰度高的離子少進來點，讓丰度低的離子多進來點。
聰明的同學可能就要問了，這個辦法在定性鑒定上十分有效，但是在定量上呢？人為的幹預檢測到肽段的比例，就如同剛剛舉得例子，我這水龍頭明明出來的是一杯牛奶，你這種方法就是在牛奶裡面強行摻水了。當然，研究人員也一定程度上解決了這個問題。在每一輪BoxCar掃描之前，均加入了一次常規的FullScan，通過將BoxCar掃描得到的譜圖，對應到Full Scan譜圖中去，即能得到每個離子m/z的傳輸效率，再計算其對應比例，得到傳輸效率係數（transmission factors），來進一步計算原本離子的丰度。（Fig.5）
在文章中關於定量方面的描述語焉不詳，個人感覺類似於match between run的做法，雖然在後續的定量驗證實驗中，研究人員給出了較好的結果（Fig.6），但是個人認為這個定量問題仍然沒有完美解決。這個問題就仁者見仁智者見智了。
後續的工作均為對該方法的驗證，同樣是常規的套路，也就不做過多說明瞭。值得一提的是，使用BoxCar的方法，在100min的梯度內，實現了小鼠腦組織中10,000個蛋白的深度覆蓋，也算是呼應標題了。
在蛋白質組學定量的研究中，有標定量和無標定量孰優孰劣一直爭論不斷，既然上文中的方法主要採用的是label-free方式，下面我們就再簡單聊一聊一篇開發新型標記試劑的研究。
這篇文章同樣來自於Felix Meissner 團隊和Mann團隊（同學們不要煩，後面還有他），於2018年6月發表於Nature Methods，題為「EASI-tag enables accurate multiplexed and interference-free MS2-based proteome quantification」3。目前主流的標記技術包括iTRAQ和TMT等，這些試劑的原理均為在二級肽段碎裂時，產生相應的報告離子用於定量。這種方法最主要的缺陷是無法確定產生的報告離子確實來源於對應的標記肽段，即在隔離母離子的時候在隔離窗口內，無可避免地會出現「共隔離」離子的幹擾（絕大部分基於質譜的蛋白質組學問題均來源於此），即在肽段碎裂的同時，釋放出的報告離子會產生互相的幹擾。另外也會產生「比例壓縮」現象，導致定量比例無法準確反映蛋白變化的實際情況。（同學們也可以思考為什麼會有這種現象）
為瞭解決這個問題，研究人員嘗試了各種各樣的方法，例如使用較窄的隔離窗口，後期數據校正和三級定量等方式。其中有一種方法，利用了肽段碎裂過程中，產生報告離子的同時，也會產生一部分未完全碎裂的「肽段+標記殘基」離子，由於平衡基團的存在，剩餘標記殘基的質量數並不相同，且於報告離子一一對應，根據這些離子就能確定報告離子是由哪些肽段所產生。
本篇文章受到這種思路，加之最近流行的MS-cleavable交聯試劑（例如DSSO）等的啟發，開發出了一種新型的標記試劑，命名為「easily abstractable sulfoxide-based isobaric-tag，EASI-tag」。（Fig.7）這種試劑具有區別於DSSO等可斷裂式交聯試劑的非對稱結構，能在較低的碎裂能量情況下進行斷裂，產生中性丟失而保留整個的肽段骨架和標記試劑殘基，這樣就能形成肽段偶聯報告離子（peptide-coupled reporters）進行定量。由於這個過程在較低的CE能量下完成，可以極大的提高肽段偶聯報告離子的產生效率，再進行常規的碎裂過程鑒定肽段碎片離子。（Fig.8）
除此之外，我們知道自然界中存在的天然同位素13C等，會導致肽段離子以「同位素峯」簇的形式出現，每個同位素峯相差約為1Da。那麼為題就來了，在隔離離子的時候，經常會共隔離這些同位素峯造成幹擾，尤其是使用了同位素標記試劑的時候。所以，為了隔離12C的同位素峯，本篇文章使用的不對稱隔離窗口，不僅降低到了0.4 Th，而且加入了-0.15 Th的偏移，令幹擾效果進一步降低。（Fig.9，圖中肽段丰度為10:3:1:1:3:10，EASI-tag試劑6標）
後續又是進行新標記方法的驗證實驗，採用了經典的「two proteome」實驗，以HeLa細胞蛋白質組作為背景，以不同比例摻入標記的酵母肽段，進行定量驗證，同樣不做贅述。不過值得注意的一點是，「ratio compression」現象具有一定程度的改善。（Fig.10）
這項研究呢，通過借鑒之前其他人的研究思路和現有交聯試劑的特徵，開發出了一種新型的標記試劑，具體的應用效果暫且不論（Spring持消極態度，希望打臉），但是充分體現了科研中舉一反三的重要作用，那麼沒有研究思路的同學們，是不是文獻啃的少了呢？
在上一期的春季篇中，介紹了一種研究小分子和蛋白質相互作用的Lip-SRM的方法，小夥伴們不知是否還有印象？通過小分子結合來保護酶切位點，是一種經典的化學蛋白質組學研究方式，接下來的文章呢，我們來聊一聊另一種「保護」措施，熱穩定。
加熱會使蛋白質變性，變性的蛋白質在溶液中會沉降，這個道理大家都懂，而蛋白質一旦與其他分子相結合，大多數情況下其穩定性會增加。根據這個原理，利用定量質譜測定不同溫度下的可溶蛋白質，就能得到其「熔化曲線」，進而就能判斷是否有蛋白質與其他分子之間的相互作用了。來自新加坡的Nordlund教授研究團隊，早在2013年就在Science上發表文章，建立了應用於活細胞的蛋白質熱穩定檢測方法cellular thermal shift assay (CETSA)4，來研究藥物與蛋白質的相互作用，而在今年的5月，他們又進一步發展了CETSA手段，在Cell雜誌上發表題為「Modulation of Protein-Interaction States through the Cell Cycle」5的研究。
首先使用化學阻滯和離心淘洗兩種不同的方式獲得了處於不同細胞週期的細胞，之後進行了2D-CETSA的實驗，即在37℃的條件下測定不同細胞週期時的蛋白質丰度變化，以及不同熱激條件下不同細胞週期時的蛋白質熱穩定性（Fig.11）。這樣就能將細胞週期過程中的蛋白質分為四類：NN，無變化；CN，僅在蛋白丰度上有變化；NC，僅在熱穩定性上有變化；CC，在丰度和熱穩定性上均有變化（Fig.12）。總體上看，研究人員共鑒定到了超過750個蛋白質在細胞週期過程中，具有顯著的CETSA信號變化，也就是這些蛋白的相互作用狀態有所改變。
既然有了這些數據，那麼就可以對整個細胞週期中不同時段的狀態變化進行描繪。舉個例子，在整個過程中會發生許多代謝反應，例如一些酶在與其底物或調節分子結合時，就會影響其熱穩定性，在CETSA實驗中，胸苷酸合成酶（TYMS）、核苷酸還原酶（RNR）和胸苷酸激酶（DTYMK）等的變化均被成功檢測。再比如，細胞週期關鍵的調控機制，CDKs和Cyclin的相互作用調控，也在實驗數據中有所體現。（Fig.13）另外，研究人員也探究了幾個細胞週期時相（S期、前中期和G2期）中特定的相互作用狀態。不過這些數據大多數是對之前已知的蛋白相互作用和複合體進行了確證，在此就不做過多介紹了，有興趣的同學還請閱讀原文。
最後，研究人員比較了這些不同細胞週期時段的蛋白相互作用狀態，發現鑒定到的發生變化的蛋白質相互作用主要發生於S期和有絲分裂期。而G1期和G2期中，蛋白質相互作用的狀態是十分類似的，這與之前我們對細胞週期的認識具有一定的差異。在G1期，細胞會不斷合成物質進行DNA複製的準備，而經歷了S期的DNA複製後，G2期主要負責對複製的DNA進行檢查和進行分裂準備，按照功能上來說，G1期和G2期的生命活動差異較大，並且在細胞形態學上，二者也完全不同。不過在CETSA實驗為我們提供的蛋白質相互作用狀態的層面上，兩個時期是非常接近的，這也讓我們有機會從另一個角度來理解和研究細胞週期這個複雜的生命活動。
當然，作為一篇能發表在Cell上的文章，其中包含的數據和細節肯定不是能在這裡用三言兩語解釋清楚的，無論感不感興趣，同學們還是應該認真研讀的。多說一句，這篇文章發表之初，也有一些「媒體」稱之為「改寫教科書」或者「顛覆常規」等，這些抓人眼球的詞語在各種文獻解讀的文章中頻頻出現，也不知道教科書更改的速度趕不趕得上文章發表的速度，至於這些到底是真正的突破還是所謂的「標題黨」，還希望大家心中有數。
好的，總結的前半句已經完畢，進入後半句，「PTM大放異彩」。蛋白質組學的優勢之一就是能測定蛋白質的翻譯後修飾（PTM），往往這些修飾對蛋白髮揮功能至關重要，其中研究最為廣泛的當屬磷酸化蛋白質組學。下面要聊的幾篇文章，均將磷酸化蛋白質組學作為主要的研究手段，我們進入正題。
2017年的炸藥獎生理學或醫學獎，頒發給了對晝夜節律做出卓越貢獻的三位科學家。但是我們對晝夜節律的調控，以及你生命中大部分時間所從事的「事業」——睡眠，的認識還相當不足。作為同學們每天「喫飯睡覺打豆豆」的日常之一，餓了就要喫，困了就要睡，看起來是再自然不過，然而有沒有深入地思考為什麼會產生睡意？「睡意」這個抽象的感覺概念是如何受到生理調控的呢？
2018年6月，劉清華教授、Masashi Yanagisawa教授和Hiromasa Funato教授等三個課題組聯合在Nature發表題為「Quantitative phosphoproteomic analysis of the molecular substrates of sleep need」6的文章，令我們對睡眠的認識，又向前邁進了一步。
不論是研究疾病還是正常的生理現象，構建模型都是最開始和重要的一步。但是要構建睡眠相關，尤其是嗜睡這種自發行為的動物模型，就是非常困難的了。好在之前Masashi Yanagisawa教授課題組利用正向遺傳篩選技術，成功構建了Sleepy嗜睡小鼠模型（H. Funato et al., Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice7. Nature 539, 378）。（劉清華教授為作者之一）
在本文的研究中，作者使用了行為模型：睡眠6小時組、剝奪睡眠6小時組和剝奪睡眠6小時後補充睡眠3小時組，以及上文提到的遺傳模型，Sleepy和WT組在剛剛進入清醒狀態時，各自取全腦組織，使用TMT標記的方法對其蛋白質組和磷酸化蛋白質組進行分析。（Fig.14）
通過分析發現，對比各組實驗，在丰度上變化的蛋白質極少，而在磷酸化的水平上變化十分劇烈，在Sleepy小鼠中大量蛋白的磷酸化水平升高，預示著磷酸化調控在睡眠過程中起到重要作用。（Fig.15）當然了，變化的雖然多，但是還是要有主次之分。研究人員發現，Sleepy組和睡眠剝奪組（SD6）中，有一些具有多磷酸化位點的蛋白，具有相似的變化模式，所以研究人員使用了「phosphorylation state change (?Ps) analysis」這一方法，即將同一蛋白質上的磷酸化位點變化程度進行加和，得出整體上磷酸化變化最大的蛋白，認為這些蛋白有可能是睡眠調控過程中最為重要的蛋白羣體之一。最終，研究人員發現了80個磷酸化程度變化最大的蛋白質，並命名為「Sleep-Need-Index-PhosphoProteins (SNIPPs)」，有趣的是，其中的69個為神經突觸結構蛋白。之後又對SNIPPs磷酸化是隨著時間積累進行了驗證，再次略過。
細心的同學可能已經發現，Sleepy小鼠明明是嗜睡模型，其睡眠時間長的離譜，但是磷酸化水平為何升高，出現了相反的結論呢？進一步通過蛋白相互作用組學的研究表明，由於Sik3突變而構建的Sleepy小鼠中，SLEEPY蛋白（Sik3突變型）相比於正常的激酶SIK3，結合了其他幾百種蛋白，其中還包括28個SNIPPs蛋白。（Fig.16）這樣就解釋的通了，SLEEPY通過磷酸化其他SNIPPs，產生了持續的睡意刺激大腦。那麼同學們想想，接下來的實驗你要怎麼做呢？
提到激酶，肯定是想到抑製劑嘛！使用Sik3的抑製劑，同樣可以抑制SLEEPY的激酶活性。使用抑製劑處理Sleepy小鼠和睡眠剝奪小鼠後，發現其SNIPPs的磷酸化程度下降，並且睡眠需求相關的生理指標也產生了降低。這些都說明，蛋白磷酸化，尤其是SNIPPs的磷酸化水平，在睡眠調控穩態中起到非常重要的作用。（Fig.17）
除了本篇文章所研究的睡眠穩態系統外，晝夜節律時鐘也是睡眠調控的重要方面。2018年4月丁琛課題組發表在Nature Communications上題為「A proteomics landscape of circadian clock in mouse liver」8的文章，系統地揭示了以轉錄因子DNA結合活性為中心，多維蛋白質組學分層調控肝臟節律，也推薦大家去看一看，在此也不做過多介紹。
好了，進入下一篇文章。上篇文章使用了遺傳學方法來構建生理性模型，使用藥物或者其他外界條件刺激構建的刺激-響應模型也是常用的研究對象之一。2018年6月，Christoph Schwarzer 教授和Matthias Mann教授團隊，在Science上發表題為「In vivo brain GPCR signaling elucidated by phosphoproteomics」9的文章，是非常經典的蛋白質組學研究，十分推薦同學們去仔細研讀。
言歸正傳，在對抗各種疾病中，人類發現或開發出的各種藥物是最強有力的手段之一。而在各種藥物的靶點中，GPCRs是其中最大的一類（A comprehensive map of molecular drug targets）。（Fig.18）其中針對阿片受體（KOR，GPCR的一種）的阿片類藥物，是廣泛應用且效果十分有效的鎮痛類藥物之一。除了良好的鎮痛效果外，阿片類藥物的副作用也十分明顯，例如噁心嘔吐、焦慮和藥物成癮依賴等。針對產生副作用這一問題，研究人員嘗試使用磷酸化蛋白質組學的方法來探討其中的分子機制。
阿片受體在神經系統中廣泛分佈但是分佈並不均勻，所以本篇研究將鼠腦分為5個不同區域來研究。（Region-resolved和Cell-type-resolved蛋白質組學是近來的熱點和發展趨勢之一）通過腦內給葯的方式，共測定了5種KOR激動劑刺激後，鼠腦中磷酸化蛋白質組學的變化，共計鑒定到了50000多個磷酸化位點。其中，激動劑U-50,488H處理後，磷酸化位點變化最大，刺激5分鐘後紋狀體中有超過1000個磷酸化位點發生變化。（Fig.19）
可以明顯的看到，大腦不同區域對KOR激動劑的刺激，呈現出極為不同的磷酸化修飾反應。此外，不僅各個區域的磷酸化修飾會變化，隨著刺激時間推移，磷酸化修飾也會發生變化。（Fig.20）
針對這些出現變化的磷酸化蛋白，研究人員發現其主要集中於突觸部分，所以接下來探究了這些KOR激動劑處理後，對突觸的信號通路會產生哪些影響。（Fig.21）U-50,488H刺激後5分鐘後，紋狀體突觸蛋白的磷酸化水平大幅度降低，從而猜測是否是由於激活了磷酸酶系統去除了一部分的磷酸化修飾。
那麼如何驗證這個猜想呢？就如同上一篇文章一樣，同樣是使用抑製劑的策略。研究人員預先使用三種不同的磷酸酶抑製劑（Tauto、Fost、Caly）來處理小鼠後，再對小鼠給予U-50,488H刺激，結果發現突觸蛋白大規模去磷酸化的現象消失（Fig.22），說明磷酸酶系統在突觸的GPCR信號轉導過程中，起到十分重要的作用。
說了這麼多，那麼引起阿片類藥物副作用的原因到底是什麼呢？通過對磷酸化差異信號通路的分析，研究人員發現在U-50,488H刺激5分鐘後，紋狀體內mTOR信號通路被顯著激活。（Fig.23）無獨有偶，之前的研究證實，mTOR信號通路在紋狀體內的異常和抑鬱等精神疾病有關，那麼阿片類藥物的副作用會不會是mTOR信號通路所導致的呢？依舊是老辦法，使用mTOR的抑製劑後再使用U-50,488H處理，結果發現小鼠模型的延誤副作用得到了明顯改善，而主要的鎮痛效果等並沒有受到影響。（Fig.23）
文章的主要結果就和大家聊到這，再次強調文章中許多細節部分並沒有一一展示，需要同學們去仔細閱讀原文。並且，這又是一篇十分經典且模式化的蛋白質組學文章，從最開始的模型構建和實驗數據展示，到尋找差異和鎖定主要研究點，再到最後的功能驗證解決提出的問題，雖然最後並沒有深入到分子機制和功能的研究探討，但是作為一篇組學文章，研究思路異常清晰和工整，各個部分已經近乎極致，是一篇不可多得的「模板化」文章，值得同學們反覆鑽研和學習。
上面的兩篇文章均是使用磷酸化蛋白質組學為手段，即測定蛋白質磷酸化修飾的變化，造成這種修飾變化的激酶/磷酸酶也是研究的重點領域，下面我們就來聊一聊一篇針對激酶的研究，發表於Nature Chemical Biology上題為「Kinome rewiring reveals AURKA limits PI3K-pathway inhibitor efficacy in breast cancer」10的文章。
Breast cancer中經常出現PI3K-ATK-mTOR通路的異常，但是針對該通路的激酶抑製劑療效卻差異很大，耐藥性的出現比比皆是。那麼藥物療效不佳和耐藥性是如何產生的？研究人員希望通過分析藥物處理後，研究激酶的變化來回答這些問題。提到激酶的大規模富集研究，同學們會想到什麼方法？
沒錯（假裝聽到了答案），目前最常用的就是由Kuster教授等開發的Kinobeads。熟悉的同學應該想到，2017年12月Kuster教授使用該方法在Science上刊文「The target landscape of clinical kinase drugs」11。本篇文章同樣使用了類似的方法，不過稍加改進，針對type I kinase inhibitors，稱之為「multiplexed inhibitor beads, MIBs」。為了能更好的代表整個乳腺癌，研究人員選取了遺傳背景各不相同的5種乳腺癌細胞，和常用的4種抑製劑進行實驗。（Fig.24）通過對比藥物刺激後，sensitive和resistance細胞中激酶的活性程度，研究人員發現確定了一個候選激酶，有絲分裂激酶AURKA。（Fig.25）
既然已經確定了候選激酶，那麼之後就是各種分子生物學的功能研究了。進一步通過WB驗證，AURKA與PI3K和AKT的抑製劑藥物抵抗性有關。（Fig.26）有了這條線索，研究人員又驗證了聯合用藥，同時抑制PI3K通路和AURKA是否能起到更好的效果。並且，PI3K通路被抑制，主要會引起細胞生長抑制，而AURKA恰恰又是一個和細胞有絲分裂相關的激酶，自然而然地，就會測定二者聯合抑制後細胞凋亡的情況。結果證實，聯合用藥確實會大大增強細胞凋亡的比例，二者具有協同效應。（Fig.27）
細胞實驗搞定了，動物實驗也不能少了。在體內二者是否還具有協同效應呢？結果一目瞭然，都不需要我再廢話了。（Fig.28）
做到這裡，已經算是個很完整的故事了。不過嘛，研究永無止境，繼續探討的問題是這種協同效應是如何產生的。先從PI3K通路的效應分子p-S6和p-4E-BP1找起。聯合用藥幾乎使p-S6的活性完全消失，而另外的p-4E-BP1在單獨使用RAD001抑制PI3K通路時，出現了明顯的升高，說明通過反饋調節，PI3K-mTOR通路的抑制並不完全再度激活，而聯合用藥組，p-4E-BP1的水平則恢復到了正常值。（Fig.29）同時也發現，使用AURKA抑製劑MLN8237，居然會使AKT的磷酸化水平下降，之後的一系列實驗也證實，AURKA通過保持AKT的活性產生了PI3K抑製劑的耐藥性。（Fig.30）而聯合用藥則會改變促凋亡和抗凋亡蛋白BAX/BCL2的比例（此處未在本文中體現，請參閱原文），從而增強了藥效。
接下來再進一步，在PI3K抑製劑處理後，是什麼調控AURKA上調使得AKT保持活性呢？在前期的PI3K抑製劑BYL719處理細胞的數據中，發現大部分MYC的靶基因很多都出現了下調的情況，那麼就將目光集中在MYC這個鼎鼎大名的蛋白上。在MYC過表達的細胞中，AURKA的表達量和磷酸化水平均出現了明顯的上升。（Fig.31）已知MYC過表達會使細胞產生耐藥性，而通過AURKA抑製劑MLN8237則能使細胞的耐藥性回復到正常水平。（Fig.32）
針對於PI3K通路耐藥性的閉環這樣就完成了。（Fig.33）說起來和上一期的文章類似，這也是一篇組學領域典型的「第一張figure」文章，利用組學的手段找出候選基因，再使用分子生物學和細胞生物學等方式研究分子機制。想起來之前實驗室一位教授說過，這種文章使用組學手段作為第一張figure，和我們組學文章最後一張figure要做「生物學」驗證是一個道理。多個學科的融合，不同技術手段的碰撞，才能令我們的研究更加深入和全面，這也和目前「大數據」和組學使用全局看待問題的思路不謀而合。
好了，雖然意猶未盡，無奈時間篇幅均有限制，本期內容就到這裡，我們又要說再見了。我是你們的好朋友Spring，青山不改，綠水長流，咱們後會有期，拜拜！
參考文獻：
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作者：Spring
編輯：張俏
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