Qualimap2简单的使用
Qualimap2是可用于对比对结果进行质控的一款软体，基于Java和R，platform-independent并且有图形用户界面(GUI)和command-line两种模式。可用来分析WGS, WES，ChIP-seq 还有 RNA-Seq的实验结果（对RNA-seq还有特别优化模式）。
分析对象可以是SAM或者是BAM文件，在Qualimap2中也支持多样本的分析。
- 快速分析在参考基因组上的覆盖度和分布情况(coverage and distribution)
- 如果提供GFF格式的区域信息，可议分析reads map到这些区域内外的情况
- 可以根据features对reads做计算和分析（可以做简单的分析啦）
- 分析RNA-seq实验的测序深度（推测是和表达量有关的）
- 表观特征聚类（ChIP-seq的部分）
下面就以RNA-seq的数据尝试一下分析吧～
1 安装
Qualimap2提供运行在Windows上的包，也提供在 LInux 和 MacOS 上运行的源码(GPL v.2)，于是先下载.zip，解压：
wget https://bitbucket.org/kokonech/qualimap/downloads/qualimap_v2.2.1.zip
unzip qualimap_v2.2.1.zip
进入文件夹运行下看看：
cd qualimap_v2.2.1
./qualimap
报错讲需要再装一些R包：
装好回来再次运行就可以进入图形界面了。
2 运行BAM file analysis
下面运行一下command-line模式下的BAM file QC， 需要sorted BAM file作为输入：
qualimap bamqc -bam ERR089819.bam -c
如果遇到可报错说RAM不足（RAM的储量，还够么！），在运行qualimap的时候可议加上参数：
qualimap --java-mem-size=1200M
qualimap bamqc -bam very_large_alignment.bam --java-mem-size=4G
BAM QC的可选参数：
-bam <arg> ：输入的BAM
-c,--paint-chromosome-limits：在chart里对染色体边界著色
-gff,--feature-file <arg>：可选的Feature文件，GFF/GTF 或者 BED 格式
-os,--outside-stats：同时也报告之前加入的gff文件区域外的部分（如果没有用-gff参数则忽略该选项）
-nr <arg>：一个chunk的reads数，默认是1000（内存大可议任性）
-nt <arg>：线程数，默认是8
-outdir <arg> ：输出HTML的文件夹
-outfile <arg>：输出pdf的文件名
-outformat <arg>：输出报告的格式 (PDF 或者 HTML, 默认的是HTML).
-sd,--skip-duplicated：加上这个参数以跳过有flag标记的duplicate alingments，如果没有放flag的话，按照qualimap自己估计进行处理
-sdmode,--skip-dup-mode <arg> ：指定处理哪些duplicate alignments，
0 :只处理比对文件里被加了flag的（默认值）
1 :只处理qualimap估计的
2 :以上两种都处理
-hm <arg>:indel分析中homopolymer最小大小（默认是3）
-ip,--collect-overlap-pairs：统计overlaping的PE reads
示例报告：
QualiMap BAM report3 RNA-seq BAM file QC
与普通的BAM QC差不多， 使用图形界面的话也可以（只是不好重复以及有些选项找不到）：
qualimap rnaseq -bam kidney.bam -gtf human.64.gtf -outdir rnaseq_qc_results
-gtf <arg>：注释文件，Ensembl GTF格式.
-oc <arg>：counts的输出路径。
-outdir <arg>：HTML报告的输出文件夹
-outfile <arg>：输出pdf的文件名
-outformat <arg>：报告格式（pdf 或者 html（默认））
-p,--sequencing-protocol <arg>：Sequencing library protocol:
strand-specific-forward,
strand-specific-reverse or non-strand-specific(默认)
-pe,--paired：对paired end的数据加这个选项时，会计数fragment而不是reads
-s,--sorted 加了这个参数表示输入文件已经排序好了，否则会按照名称排序
示例报告：
QualiMap RNAseq report4 其他功能
除此之外还有 Multisample的BAM QC, Counts QC，Clustering，Computing counts 等功能，有需要的话可议去Qualimap2的网站上继续探索哟。
Multisample的BAM QC：
qualimap multi-bamqc -i gh2ax_chip_seq.txt -outdir gh2ax_multibamqc
gh2ax_chip_seq.txt：
sample_1 sample_1_stats group_1
sample_2 sample_2_stats group_1
sample_3 sample_3_stats group_1
sample_4 sample_4_stats group_2
sample_5 sample_5_stats group_2
sample_6 sample_6_stats group_2
示例报告：
Qualimap Multisample report参考来源：
A survey of best practices for RNA-seq data analysis(2016), Ana Conesa等
Evaluating next generation sequencing alignment data
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