[微生物实验05]107/10/25(肠杆菌菌种鉴定：生化8管)

其实临床实际上不会真的做到8管，实验课练习才做了一整套~

〈氧化酶试验(Spot Oxidase test―Kovac's Method〉

一、实验目的：测试未知的C菌和D菌是否拥有氧化酶，进而做其他实验来鉴定。

二、实验原理：能行有氧呼吸的细菌拥有细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase)，此酶会氧化实验试剂(tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride )，产生indophenol，试剂颜色就会从淡黄色变成紫黑色，所以我们可借由加入试剂后的颜色变化来得知细菌是否拥有氧化酶(不变色→阴性；变色→阳性)。

三、实验材料与器材：

1.菌种： 24hr培养未知的C菌和D菌、P.aeruginosa

2.器材： loop、打火机、酒精灯、agar plate、滤纸、tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD)、incubator

四、实验方法：

1. 将三片滤纸分别做好标示

2. 用灭菌过的loop分别沾取C菌、D菌、绿脓杆菌涂至滤纸上

3. 滴上TMPD

4. 观察10秒内颜色的变化

五、实验结果：

〈生化八管试验〉

一、实验目的：肠内菌(Enterobacteriaceae)可分为许多属，都是Gram stain(-)，若要进一步区分就必须利用生化实验来检验其代谢产物。每一生化实验的结果都有其代码，利用GFB-14E电脑密码鉴定系统来查表，可得知拥有此一系列生化特性的菌可能的种类。

二、实验方法：总共有6个生化实验，以下逐一描述，结果统一于最后总结。

1. Triple Sugar Iron Agar (TSI Agar test)

(1) 原理：此为定性实验。TSI Agar含有1% lactose、1% sucrose、1% glucose以及pH指示剂(phenol red)，可观察细菌利用糖类的情形；另含ferrous mmonia sulfate，用来测知细菌产硫化氢(H₂S)的情形。

(2) 材料：TSI agar slant、needle、酒精灯、未知的C菌和D菌、incubator

(3)方法：

① 将tube标示好(TSI )

② 将needle过火灭菌，沾取菌落在slant表面画蛇纹，再刺入2/3深

③ 将tube松盖，在incubator培养24hr后观察变化

2. Citrate Utilization Test

(1)原理： Simmons citrate agar内含有柠檬酸与Bromothymol blue(酸碱指示剂)，若是细菌能够利用柠檬酸，则会有碱性副产物产生，培养基颜色将由绿转蓝。

(2)材料： Simmons citrate agar、loop、酒精灯、未知的C菌和D菌、incubator

(3)方法：

① 将tube标示好(Cit)

② 将loop过火灭菌，沾取菌落在slant表面画蛇纹

③ 在incubator培养24hr后观察变化

3. Urease test

(1) 原理：将细菌接种于含phenol red(酸碱指示剂)与urea broth medium中，若细菌拥有urease则会分解urea，产生ammonia，最后形成(NH₄)₂CO₃，使pH升高，agar会变为桃红色。

(2) 材料： urea agar、loop、酒精灯、未知的C菌和D菌、incubator

(3)方法：

① 将tube标示好(Ure)

② 将loop过火灭菌，沾取菌落在slant表面画蛇纹

③ 在incubator培养24hr后观察变化

4. Sulfide Indole Motility (SIM) test

(1) 原理： SIM agar内含有大量的tryptophan，为半固体培养基，可观察细菌是否拥有tryptophanase和运动性。若细菌有tryptophanase，在培养24hr之后加入Kovac's reagent会和其代谢tryptophan产生的indole形成红色复合物；若有运动性，则培养后会发现agar变混浊。

(2) 材料：SIM agar、Kovac's reagent、酒精灯、未知的C菌和D菌、incubator、dropper、needle

(3)方法：

① 将tube标示好(SIM)

② 将needle过火灭菌，沾取菌落垂直刺入2/3深

③ 在incubator培养24hr后观察有无IPA(棕色环)，agar有无混浊

④ 纪录完后加入10滴Kovac's reagent

⑤ 观察有无变色

5. Voges-Proskauer test (VP test)

(1) 原理： pyruvate是发酵葡萄糖时产生的化合物，有的细菌会将pyruvate进一步代谢，产生acetoin；在正常大气压的含氧量下加入40%的KOH，acetoin会反应成diacetyl，再加入α-naphthol作为触媒，会成为红色复合物。

(2) 材料： MR-VP Broth or semisolid agar、6% α-naphthol、40%KOH、酒精灯、未知的C菌和D菌、incubator、dropper、needle

(3)方法：

① 将tube标示好(VP)

② 将needle过火灭菌，沾取菌落垂直接种数次

ya戳好戳满~~来回抽插~~半固体的胶都快烂掉ㄌ

③ 在incubator培养24hr后，加入12滴α-naphthol

④ 再加入4滴KOH，稍微摇动混合

⑤ 静置15分钟后观察

6. Lysine decarboxylase test、Arginine dihydrolase test、Ornithine decarboxylase test

(1) 原理：检测菌种是否有此三种氨基酸酵素。此三管培养基中都含有bromcresol purple(酸碱指示剂)，若细菌拥有上述酵素，则会代谢出碱性产物，使培养基变为紫色。

(2) 材料： Moller's ornithine decarboxylase medium、Moller's lysine decarboxylase medium、Moller's arginine dihydrolase medium、酒精灯、未知的C菌和D菌、iincubator 、dropper、loop、矿物油

(3)方法：

① 将tube分别标示好(Lys、Arg、Orn)

② 将loop过火灭菌，沾取菌落分别接种于三支培养基

③加入2 ml矿物油使medium呈无氧状态

④ 在incubator培养24hr后观察

三、实验结果：