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https://www.nature.com/articles/s41591-019-0349-y

編譯者按

GBM中免疫治療持續升溫，但是一直缺乏顯著的證據支持，最近的一項臨牀試驗也指出在復發GBM中PD-1免疫檢查點抑制劑只在8%的患者身上有客觀緩解率。抗PD-1免疫治療主要是通過阻斷腫瘤細胞和T細胞的PD-1/PD-L1結合，從而避免T細胞耗竭，增加自身T細胞對腫瘤的殺傷能力。目前抗PD-1免疫治療療效的影響因素主要與腫瘤突變負荷和T細胞浸潤率有關，而GBM相比較於目前獲得較大成功的非小細胞肺癌以及黑色素瘤來說，腫瘤突變負荷低，並且具有免疫抑制的微環境，因此想在GBM中實現PD-1抑制劑治療是十分困難的。但是臨牀上仍存在難以解釋的獲益於免疫治療的患者，其背後的深層原因可能是GBM免疫治療突破的契機。

研究方法

本研究入組66例患者進行回顧性研究，入選標準是經過標準治療後復發GBM的成人患者，復發後進行PD-1抑制劑治療（pembrolizumab或者nivolumab），並依據療效分成反應組和非反應組人羣。反應組人羣的診斷標準爲滿足下面任何一條：1）PD-1抑制劑治療後進行手術切除的組織樣本大部分只表現出炎性反應，很少或沒有腫瘤細胞存在（可能表現出假性進展）；2）至少6個月內MRI顯示腫瘤體積維持穩定或者持續縮小。

圖1. 研究患者入選標準和實驗流程

生存分析

隨後對入組患者的臨牀和個人信息的統計包括反應模式、治療初始年齡、性別、選用的PD-1抑制劑種類進行了單因素生存分析。發現對PD-1抑制劑的反應性和患者從免疫抑制劑治療開始的總生存期（OS）顯著相關：反應性人羣的平均生存期爲14.3個月，而非反應性人羣的平均生存期僅爲10.1個月（P=0.0081，log-rank test）。

圖2. 抗PD-1免疫治療GBM反應組以及非反應組生存曲線

測序結果

進一步研究人員分析了17個患者配對的58個全基因組樣本和38個轉錄組樣本，合併39個患者的基因測序結果，並得到如下的結果及分析。

1. 反應組和非反應組差異

檢測的腫瘤樣本中平均有47個非同義體細胞突變，在反應組和非反應組間，非同義單核苷酸變異數，非整倍體數以及人白細胞抗原I（HLA-I）表達沒有顯著差異。有報道說在黑色素瘤以及非小細胞肺癌患者中HLA-I基因的相似性影響免疫治療的生存期，但是在本實驗GBM樣本中沒有顯著效果。

2. 基因通路改變和突變差異

腫瘤細胞中PTEN基因缺失可以導致腫瘤浸潤T細胞減少，抑制細胞自噬，降低T細胞介導的腫瘤細胞殺傷，並且在GBM中也證實T細胞可以更有效殺傷PTEN基因野生型的腫瘤細胞。

反應組和非反應組患者的基因突變信息表明，在IDH1野生型患者中，PTEN突變顯著聚集在非反應組中（P=0.0063），即便相比於人羣中的PTEN突變基線（33%，TCGA）也明顯升高（P=0.0018）。

使用單樣本基因富集分析（single-sample geneset enrichment analysis, ssGSEA）計算腫瘤樣本中的PI3K-AKT通路的基因富集情況，在PTEN突變的PD-1抑制劑非反應組腫瘤中PI3K-AKT通路活性顯著高於反應組。並且發現另一條顯著改變的MAPK通路，MAPK通路突變在之前的黑色素瘤研究中證明與免疫治療的效果相關。相比較於人羣中的統計突變率（7.8%，TCGA）和非反應組，MAPK通路的基因（BRAF和PTPN11）突變在反應組中更顯著（P=0.018）。

圖3. 抗PD-1免疫治療GBM反應組與非反應組調控基因統計

藍色，反應組樣本；黃色，非反應組樣本

由於免疫治療過程中可能存在篩選出低免疫原性腫瘤細胞的作用，因此針對5個患者樣本（2個PD-1抑制劑非反應組患者，3個反應組患者）建立免疫治療前後的進化樹。非反應組和反應組表現出不同的進化模式，非反應組表現出線性進化模式，而反應組表現出分支進化模式。在三個反應組患者樣本中均有：治療前的具有表達特定免疫原性新抗原表位的基因，而在治療後消失的情況。

圖4. 反應組與非反應組在治療中的進化模式

通過T細胞抗原受體（T cell antigen receptor, TCR）和免疫球蛋白RNA序列跟蹤腫瘤中淋巴細胞的進化過程，發現非反應組患者具有更高的T細胞克隆多樣性（P=0.024），免疫球蛋白的跟蹤監測中也發現了同樣的規律（P=0.048），說明了B細胞和T細胞在PD-1抑制劑治療反應性上的協同作用。

圖5. 反應組和非反應組的免疫治療前後TCR多樣性

通過分化富集分析MSigDB中的基因信息，發現PD-1抑制劑治療前，在非反應組樣本中有調節性T細胞（Treg細胞）相關的基因富集（P=0.037），其基因表達也更活躍。表達FOXP3的Treg細胞可以抑制自體免疫反應，抑制癌症過繼免疫治療的效果。在免疫治療的過程中，反應組的腫瘤免疫抑制基因如FOXP3和STAT3，以及調控腫瘤免疫侵襲特徵的基因表達更加活躍。

對腫瘤樣本的組化結果顯示Treg細胞並非來自於腫瘤細胞，對GBM的9000個細胞進行轉錄組學研究，發現PTEN突變的腫瘤富有免疫抑制的特徵。進一步拓撲學分析發現了三個重要的細胞羣：小膠質細胞，繁殖旺盛的腫瘤細胞（Ki-67+），具有轉移標誌物（CD44+）的腫瘤細胞，其中CD44+相關的腫瘤中免疫抑制的特徵最顯著。

圖6. 表達CD44腫瘤細胞免疫抑制環境的細胞組分

上述研究證明PTEN能夠在腫瘤免疫微環境的形成中起重要作用，從TCGA數據庫提取分析了172個樣本中的RNA-seq信息，PTEN突變和FOXP3相關的轉錄特徵以及低腫瘤均一性顯著相關（P=0.028）。單樣本基因富集分析測量每個樣本中的24種免疫細胞的浸潤情況，PTEN突變和腫瘤微環境中的巨噬細胞，小膠質細胞以及中性粒細胞顯著相關（P<0.05）。研究人員曾在膠質瘤研究中發現腫瘤相關巨噬細胞釋放生長因子，細胞因子可以促進腫瘤的增殖，生存以及遷移。

研究是否PTEN突變和腫瘤微環境的組成結構相關，利用定量多重免疫熒光（quantitative multiplex immunofluorescence，qmIF），分析17個患者配對PD-1抑制劑治療前後的FFPE（formalin-fixed paraffin embedded）染色樣本，PTEN突變腫瘤有更高的CD68+巨噬細胞的浸潤，但結果不顯著，進一步細化分類，發現CD68+HLA-DR-的巨噬細胞在PTEN突變的樣本中比例顯著升高（P=0.011）。而免疫治療後，PTEN野生型的樣本中CD3+T細胞（CD8+/-）密度顯著升高（P=0.0095），PTEN突變型樣本中則不具有相關變化。

圖7. 免疫治療前後特殊標記細胞類型的比例

評估不同細胞類型間的聚集程度，利用空間統計方法，免疫治療前PTEN突變樣本中腫瘤細胞聚集更加緊密（P=2.4x10-4），而PTEN野生型樣本中巨噬細胞在治療後聚集程度更高（P=0.0012），在PTEN突變細胞中剛好得到相反的結果（P=0.032）。

總結

首先發現抗PD-1治療有效的GBM患者總生存期更長，在本實驗中，非反應組PTEN突變比例更高，RNA-seq證明PTEN突變可以誘導免疫抑制的腫瘤微環境，而這種免疫特徵並非來源於傳統意義上的Treg細胞，而是過表達CD44的腫瘤細胞，通常意味着更高的細胞活動性和GBM的侵襲性。組化分析證實在PTEN突變的腫瘤中T細胞浸潤不足。通過空間統計分析發現PTEN突變的腫瘤細胞聚集程度更高，一定程度上可以阻止免疫細胞的浸潤，有益於腫瘤細胞的存活。MAPK信號通路在以往的研究中和腫瘤免疫的不良預後相關，但是在一項臨牀前研究中表明MAPK通路的抑制可以提高免疫治療的效果，在本隊列中也是體現爲MAPK通路中BRAF/PTPN11的突變在對抗PD-1治療有效的患者組羣衆更顯著。實際上也可能存在交聯的調控網絡，如在前列腺癌中存在的PTEN-PTPN11通路軸調控免疫抑制。

另外在本研究中也體現了GBM在免疫治療過程中的進化特徵，也證明免疫系統在腫瘤的發生過程中也起到了篩除高免疫原性表位的“腫瘤編輯”作用，同樣在免疫治療後也存在免疫抑制相關基因的高度活躍，從而促進腫瘤的免疫逃逸和存活。

編譯作者

北京協和醫院神經外科、北京協和醫學院臨牀醫學八年制2014級博士生 劉芃昊

本期編審

北京協和醫院神經外科副主任醫師王裕 副教授，醫學博士、留美博士後

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