ELISA開發定製之抗體製備

有幸在國內一家生物製藥行業較為出名的企業待過一段時間，並且也成功領導過其中一項疫苗產品的臨床前期開發工作。平時工作老是自我安慰工作比較忙（其實是自己偷懶），總想找個機會總結一下這些年來的生物製藥開發心得（感謝知乎有這麼一個平台和大家交流）。寫的文章中有什麼不對的地方，也歡迎同行批評指正。我接觸較多的是病毒類的疫苗開發工作，其次是細菌類的疫苗開發工作。篇幅有限，決定還是從方法開發這塊先開始講講吧。

眾所周知，生物葯的開發，其各項指標的控制是非常嚴格的，尤其是人用藥物的指標控制方面，包括中國藥典，歐盟藥典，日本藥典，美國藥典以及ICH（人用藥）指導原則，關於生物葯這塊，其各項條例和實驗方法等採用和設定都有相應的規定。實際研發過程中，各項指標的控制和方法的控制要遠遠高於藥典的規定，比如說在檢測病毒種子外援病毒時，我見過有的企業要同時測定多大130多種病毒，以確定病毒種子的安全性。就實驗方法來說，ELISA絕對是非常常用的，能夠大規模篩選和檢測樣品，並且是價格相對比較低廉的方法，沒有之一（至少我所熟知的生物製藥企業，ELISA是常規、高通量方法）。言歸正傳，說說ELISA方法開發吧。

ELISA (酶聯免疫吸附反應) 是一種基於固相載體中的高通量篩選技術，被廣泛應用於定性，定量檢測樣品中多肽，蛋白，抗體和激素的含量。在ELISA實驗中，抗體或者抗原需提前預結合到酶標板（96孔板）中，再利用辣根過氧化物酶（HRP），鹼性磷脂酶（AP）或者其他化學發光基團標記的抗體或者抗原進行顯色反應。ELISA方法分為主要有四種，後三者較為常用，並各自具有特點：ELISA夾心法、競爭法（測定抗原），間接法（測定抗體）或競爭法（測定小分子化合物）。

夾心ELISA法，又稱為Sandwich ELISA，這種方法被廣泛的用於檢測抗原。基本原理是將抗體採用碳酸鹽緩衝液包被到固相載體上，加入待檢測樣品後，再加入HRP、AP標記的檢測抗體，通過顯色反應測定待測樣品中的特定抗原含量，如監控疫苗開發過程中總抗原的含量變化等。

間接ELISA法，這種方法被廣泛的用於檢測抗體。基本原理是將抗原採用磷酸鹽緩衝液包被到固相載體上，加入待檢測樣品後，再加入HRP、AP標記的抗抗體，通過顯色反應測定待測樣品中的特定抗體含量，如檢測血液中某種抗體的含量等。

競爭ELISA法，這種方法被廣泛的用於檢測小分子抗原，如抗生素，食品農藥殘留等。與其他幾種方法最大的區別是，在實際操作中樣品中待測物質濃度越高，顯色反應越低；反之，當待測物質濃度越低，顯色反應程度越高。這是因為，將小分子抗原固定在酶標板之後，加入待測樣品和酶標檢測抗體，樣品中遊離的待測小分子抗原會與酶標檢測抗體結合，導致酶標檢測抗體與酶標板固相抗原結合數量減少，最終顯色反應水平光密度值減少。

從上面的介紹可以都看到，ELISA方法的開發實際上就是圍繞著抗體的開發工作工作。而為了獲得一株理想的單克隆抗體，往往我們會付出非常艱辛的勞動，關鍵是付出不一定會報！

在ELISA開發工作中，抗體的篩選工作極其重要，方案的提前設計師重中之重。在剛入行的時候，為了獲得一株理想的單克隆抗體，我們團隊篩選過超過10,000株單抗，最終結果宣告失敗，總結原因：篩選方案設計不合適，討論不充分。舉個例子來說吧，以病毒P為例。病毒P有三個血清型，分別為P1,P2和P3，這三個血清型最大的差別的是結構蛋白VP1上有若干個氨基酸的差別（序列上，空間結構暫時不清楚），為了能夠在體外監控這個三個血清型病毒在動物體內的免疫效力與病毒注射量直接的定量關係，ELISA就是一個比較好的方法（還是省錢！！！），那麼我們在方案制定時，就需要考慮如何設計合適的篩選手段，從上萬的克隆中篩到目標的抗體（共3株），而目標抗體不僅能區分血清型（沒有交叉反應），而且能高效地區分有效抗原（有效抗原是指能夠引起機體免疫反應的抗原，往往製備的抗原是無效抗原和有效抗原的混合物）。我們將方案分為3個階段：免疫階段、細胞克隆和篩選階段以及驗證階段。

免疫階段：免疫階段的重心在於如何獲得高質量的抗原。就我所知，大部分用於抗體製備的抗原純度是不夠的（很多定製斯要求是>85%即可），並且抗原的完整性對於目標抗體的獲取有極大影響。從完整性方面來考量，除了純度指標以外，我覺得應該有這樣一個排序：完整的病毒抗原>不完整的病毒抗原>部分抗原表位（重組病毒結構蛋白）>多肽、小分子抗原。其中完整的病毒抗原又可以具體排序：完整的非滅活病毒抗原>完整的滅活病毒抗原（抗體中和效價水平能相差10，000倍左右），我們曾用非滅活的病毒抗原免疫牛，羊，其抗體中和效價能達到10*8（10的8次方），而滅活過的完整病毒抗原（經過驗證的）只能達到10*4。純化病毒，不論是採用分子篩，還是密度梯度離心等方法，先期需要將純化過程樣品進行階段分裝，經過蛋白定量後，免疫小鼠進行中和效價（非ELISA效價）評定，取效價高者抗原進行精細純化並製備高質量抗原。

細胞克隆、篩選和驗證下次再敘。