ELISA开发定制之抗体制备

有幸在国内一家生物制药行业较为出名的企业待过一段时间，并且也成功领导过其中一项疫苗产品的临床前期开发工作。平时工作老是自我安慰工作比较忙（其实是自己偷懒），总想找个机会总结一下这些年来的生物制药开发心得（感谢知乎有这么一个平台和大家交流）。写的文章中有什么不对的地方，也欢迎同行批评指正。我接触较多的是病毒类的疫苗开发工作，其次是细菌类的疫苗开发工作。篇幅有限，决定还是从方法开发这块先开始讲讲吧。

众所周知，生物药的开发，其各项指标的控制是非常严格的，尤其是人用药物的指标控制方面，包括中国药典，欧盟药典，日本药典，美国药典以及ICH（人用药）指导原则，关于生物药这块，其各项条例和实验方法等采用和设定都有相应的规定。实际研发过程中，各项指标的控制和方法的控制要远远高于药典的规定，比如说在检测病毒种子外援病毒时，我见过有的企业要同时测定多大130多种病毒，以确定病毒种子的安全性。就实验方法来说，ELISA绝对是非常常用的，能够大规模筛选和检测样品，并且是价格相对比较低廉的方法，没有之一（至少我所熟知的生物制药企业，ELISA是常规、高通量方法）。言归正传，说说ELISA方法开发吧。

ELISA (酶联免疫吸附反应) 是一种基于固相载体中的高通量筛选技术，被广泛应用于定性，定量检测样品中多肽，蛋白，抗体和激素的含量。在ELISA实验中，抗体或者抗原需提前预结合到酶标板（96孔板）中，再利用辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷脂酶（AP）或者其他化学发光基团标记的抗体或者抗原进行显色反应。ELISA方法分为主要有四种，后三者较为常用，并各自具有特点：ELISA夹心法、竞争法（测定抗原），间接法（测定抗体）或竞争法（测定小分子化合物）。

夹心ELISA法，又称为Sandwich ELISA，这种方法被广泛的用于检测抗原。基本原理是将抗体采用碳酸盐缓冲液包被到固相载体上，加入待检测样品后，再加入HRP、AP标记的检测抗体，通过显色反应测定待测样品中的特定抗原含量，如监控疫苗开发过程中总抗原的含量变化等。

间接ELISA法，这种方法被广泛的用于检测抗体。基本原理是将抗原采用磷酸盐缓冲液包被到固相载体上，加入待检测样品后，再加入HRP、AP标记的抗抗体，通过显色反应测定待测样品中的特定抗体含量，如检测血液中某种抗体的含量等。

竞争ELISA法，这种方法被广泛的用于检测小分子抗原，如抗生素，食品农药残留等。与其他几种方法最大的区别是，在实际操作中样品中待测物质浓度越高，显色反应越低；反之，当待测物质浓度越低，显色反应程度越高。这是因为，将小分子抗原固定在酶标板之后，加入待测样品和酶标检测抗体，样品中游离的待测小分子抗原会与酶标检测抗体结合，导致酶标检测抗体与酶标板固相抗原结合数量减少，最终显色反应水平光密度值减少。

从上面的介绍可以都看到，ELISA方法的开发实际上就是围绕著抗体的开发工作工作。而为了获得一株理想的单克隆抗体，往往我们会付出非常艰辛的劳动，关键是付出不一定会报！

在ELISA开发工作中，抗体的筛选工作极其重要，方案的提前设计师重中之重。在刚入行的时候，为了获得一株理想的单克隆抗体，我们团队筛选过超过10,000株单抗，最终结果宣告失败，总结原因：筛选方案设计不合适，讨论不充分。举个例子来说吧，以病毒P为例。病毒P有三个血清型，分别为P1,P2和P3，这三个血清型最大的差别的是结构蛋白VP1上有若干个氨基酸的差别（序列上，空间结构暂时不清楚），为了能够在体外监控这个三个血清型病毒在动物体内的免疫效力与病毒注射量直接的定量关系，ELISA就是一个比较好的方法（还是省钱！！！），那么我们在方案制定时，就需要考虑如何设计合适的筛选手段，从上万的克隆中筛到目标的抗体（共3株），而目标抗体不仅能区分血清型（没有交叉反应），而且能高效地区分有效抗原（有效抗原是指能够引起机体免疫反应的抗原，往往制备的抗原是无效抗原和有效抗原的混合物）。我们将方案分为3个阶段：免疫阶段、细胞克隆和筛选阶段以及验证阶段。

免疫阶段：免疫阶段的重心在于如何获得高质量的抗原。就我所知，大部分用于抗体制备的抗原纯度是不够的（很多定制斯要求是>85%即可），并且抗原的完整性对于目标抗体的获取有极大影响。从完整性方面来考量，除了纯度指标以外，我觉得应该有这样一个排序：完整的病毒抗原>不完整的病毒抗原>部分抗原表位（重组病毒结构蛋白）>多肽、小分子抗原。其中完整的病毒抗原又可以具体排序：完整的非灭活病毒抗原>完整的灭活病毒抗原（抗体中和效价水平能相差10，000倍左右），我们曾用非灭活的病毒抗原免疫牛，羊，其抗体中和效价能达到10*8（10的8次方），而灭活过的完整病毒抗原（经过验证的）只能达到10*4。纯化病毒，不论是采用分子筛，还是密度梯度离心等方法，先期需要将纯化过程样品进行阶段分装，经过蛋白定量后，免疫小鼠进行中和效价（非ELISA效价）评定，取效价高者抗原进行精细纯化并制备高质量抗原。

细胞克隆、筛选和验证下次再叙。