同學們，之前給大家介紹了篩選型蛋白互作的研究方法3——BioID的實驗原理和流程，這周我們將給大家介紹篩選型蛋白互作研究的第4種方法SILAC-IP/AP，是該專題系列的最後一堂課。

實驗原理：

SILAC技術利用含輕、中或重型同位素標記的必需氨基酸（主要是Lys和Arg）培養基培養細胞，來標記不同實驗組別細胞中新合成的蛋白質，一般培養5-6代，細胞中的蛋白質將都被同位素標記上。之後再結合免疫沉澱技術（IP）或親和純化技術（AP）來捕獲誘餌蛋白的互作複合物，互作複合物經預處理，質譜分析，即可得到複合物中蛋白的定量及定性結果；統計分析，當實驗組與對照組中某個蛋白質含量達到統計學差異時，即可判定該蛋白質與誘餌蛋白質存在互作。

針對不同實驗材料有2種不同的方案可選：

方案一：以正常細胞株為實驗材料(圖1)

（1）分別用輕、重鏈氨基酸培養細胞，培養至第5-6代時取等量細胞提取蛋白質；

（2）提取的輕鏈、重鏈細胞總蛋白分別用Normal IgG和抗bait蛋白的特異抗體做免疫沉澱；

（3）分別取部分輕、重鏈IP產物，做WB檢測誘餌蛋白的IP效果；

（4）在確保IP效果良好的情況下，等量混合輕、重鏈IP產物；

（5）對混合後的IP蛋白溶液進行酶解、肽段純化，質譜檢測。

（圖1：成對出現的峰為非特異性結合蛋白，在質譜結果上體現為某蛋白在輕、重鏈組的比值接近於1）。

方案二：以過表達bait蛋白的細胞株為實驗材料(圖2)

（1）分別用輕、重鏈氨基酸培養正常對照細胞和過表達bait蛋白的細胞株(帶標籤)，培養至第5-6代時，裂解細胞，2組取等量蛋白質混合；

（2）混合的輕、重鏈細胞總蛋白用標籤蛋白抗體做IP；

（3）WB檢測IP產物中誘餌蛋白的IP效果；

（4）在確保IP效果良好的情況下，對蛋白溶液進行酶解、肽段純化，質譜檢測。

（圖2：成對出現的峰強一致的峰為非特異性結合蛋白，在質譜結果上體現為某蛋白在輕、重鏈組的比值接近於1）。

技術的優點和缺點：

優點：SILAC-IP/AP靈敏度高，可根據定量比值篩選假陽性蛋白，顯著降低鑒定結果的假陽性率。

缺點：是該技術主要適用於可傳代的細胞或細菌，其他實驗材料不適用。

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