Nature | 快速、準確、經濟：CRISPR技術在疾病檢測中的崛起
編譯 | 亦初
原文丨Amy Maxmen
責編丨迦漵
近日，Nature新聞版塊報道了基於基因編輯技術開發了可用於拉沙熱等疾病早期診斷的方法，這有助於控制這些烈性傳染病的傳播。
拉沙熱(Lassa fever)是在奈及利亞、幾內亞、賴比瑞亞和獅子山等西非地區流行的一種人畜共患疾病，是由拉沙熱病毒（沙狀病毒科，單鏈RNA病毒）引起的，感染後病程1-4周；該病毒因其治療難度和傳染性被評為危險等級最高的病毒（生物安全第四級：給人類造成致命的疾病，並且在絕大多數的情況下是不可救治的，最著名、危害最大的病毒要數埃博拉病毒Ebola和拉沙病毒Lassa）。
快速、準確且經濟是對理想診斷方式的基本要求，此外還應該兼顧操作的簡便性（操作不需要專業人員、簡單培訓即可）、盡量避免專業設備和過強的基礎設施要求（如電力條件等）。因為埃博拉病毒（Ebola virus）、拉沙病毒（Lassa virus）等疫情常常在偏遠地區爆發，如果有理想的診斷技術，便可儘早發現患者，然後將其隔離治療，避免疫情的擴散。因此，快速、準確地診斷傳染性疾病是防控重大疫情傳播的關鍵。
CRISPR分子診斷技術的開發
麻省理工學院(MIT)和哈佛的Broad Institute的張峯團隊正在努力開發CRISPR- Cas13分子診斷技術 。Cas13蛋白不像用於基因編輯的Cas9蛋白，它在切割靶序列後會不加選擇地切割碰到的RNA（collateral cleavage）；這一特性使其不能被用於基因編輯，但對診斷來說卻是個福音，該切割能增加檢測信號的靈敏度。2018年，他們把這種診斷技術命名為SHERLOCK（Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOKing）【1】，該系統包含Cas13、對應的靶向待檢測病毒的sgRNA和包含一個切割後可發出熒光的報告RNA鏈；當這些Cas13蛋白識別到靶向RNA鏈時會切割相應的模板，隨後激活了它的collateral cleavage活性，進而切割報告RNA並釋放可檢測的熒光信號（圖1）。
張鋒團隊在升級後SHERLOCKv2系統中增加了Cas蛋白的種類（LwaCas13a 、PsmCas13b、CcaCas13b 和AsCas12a）【2】，這樣可以同時檢測到四種病毒（圖2）；並利用CRISPR type-III中的Csm6酶（重新設計RNA的報告序列，使其被Cas13剪切的末端序列為2』,3』-環磷酸的線性腺苷酸，從而激活Csm6的酶活）放大其檢測信號，進一步增強了使得該方法的靈敏度。CRISPR分子診斷技術的檢測精度有望跟傳統的檢測方法一樣，而使用方法跟家庭驗孕棒一樣簡單（圖3）。CRISPR系統只要設計好特異的sgRNA就可以靶向特定的核酸序列，研究人員希望能在一週內鑒定出病毒爆發區域的任何毒株。
加州大學伯克利分校的Doudna團隊發現當Cas12a蛋白在剪切靶向的dsDNA 後能高效地切割非特異性單鏈 DNA（ssDNA），基於此開發了DETECTR（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）技術（圖4）【3】； 該系統包含Cas12a、靶向特定序列的sgRNA和非特異性 ssDNA 熒光報告序列（FQ-labeled reporter）。一旦Cas12a檢測到目的 DNA序列便會切割靶序列，接著熒光報告序列也會被切割，從而釋放出熒光信號。DETECTR 技術可以準確地檢測出是否有高危型HPV病毒感染：HPV16（100%）、HPV18 （92％）。DETECTR測試單次成本不到一美元，只需一個小時；該技術具有快速、準確、易用的特點，尤其適合HPV的大規模普查。「這是CRISPR領域特別令人興奮的方向」， 加州大學伯克利分校的生物化學家Jennifer Doudna說。
Doudna希望這項技術能幫助非洲國家遏制宮頸癌死亡人數的上升，這些國家的宮頸癌患者無法治療常常是因為確診太晚。去年，她在舊金山與人共同創立了公司（Mammoth Biosciences，獲得2300 萬美元 A 輪融資），想進一步發展這種診斷方法；她們正在用加州人的血液樣品進行HPV病毒的檢測。此外，她們還想把新發現蛋白尺寸更小的Cas14和CasX蛋白用於診斷技術中【4，5】，更加豐富了CRISPR分子診斷的相關技術。
值得一提的是中科院上海植物生理生態研究所趙國屏院士團隊王金博士也發現了Cas12a對於靶標ssDNA和非靶標ssDNA的切割特性，相關工作發表在Cell Research雜誌上（詳見BioArt：一個悲喜參半的故事丨植生所王金博士等報道Cas12a對於靶標ssDNA和非靶標ssDNA的切割特性研究）。基於該原理，研究團隊也開發了核酸快速檢測體系，相關工作正在投稿中。
CRISPR分子診斷技術在疫情地區的應用
研究團隊正在奈及利亞測試這種新型的CRISPR分子診斷技術對拉沙病毒檢測的準確性如何（圖5），並將檢測結果跟實驗室傳統的方法PCR這類診斷金標準進行對比。最終發現SHERLOCK檢測技術的費用是傳統PCR檢測方法的一半，並且節約了一半的時間（從4個小時縮短到2個小時）。雖然兩種診斷方法處理樣品時均需要電力，但斷電對SHERLOCK技術的影響不像PCR技術那麼大，而在奈及利亞經常發生斷電。如果該方法最終能被應用於病毒爆發的地區，這將有助於早期檢測出病毒感染者，從而提高患者治療的療效，進而遏制病毒的廣泛傳播。
奈及利亞的分子生物學家Jessica Uwanibe說，可靠、易用的拉沙病毒檢測技術能減少高達60%拉沙熱患者的死亡，這是一項可以挽救很多人性命的事業。
宏都拉斯和美國加州的科學家正在用CRISPR介導的分子診斷技術測試登革熱病毒（dengue viruses）、寨卡病毒（Zika viruses）和人類乳頭瘤病毒（HPV）的檢出效率；而在剛果民主共和國CRISPR分子診斷技術被用於埃博拉病毒（Ebola virus）的檢測。
不可忽視的市場力量
世界衛生組織駐奈及利亞技術官員Dhamari Naidoo說：「這些事非常令人興奮的創新，」 但她補充道，如果想讓CRISPR分子診斷技術在低收入國家中產生足夠的影響，研究人員必須確保該技術的授權、製造和價格等這些國家能負擔得起。
Naidoo說，研究人員常常忽視那些因素，比如各國研究人員大約開發了12種埃博拉病毒（Ebola）的診斷試劑，但只有2種試劑能在剛果（金）埃博拉疫情爆發後應用。其餘的均因經濟原因受阻，如試劑的市場容量不足抵消製造和分銷這些產品的成本。
由於伯克利和Broad之間仍存在專利之爭，從經濟角度來看基於CRISPR的分子診斷技術可能尤其麻煩。但Doudna和Pardis Sabeti（SHERLOCK項目負責人之一）兩個團隊均表示她們正致力於授權這些工具，以確保需要這些分子診斷工具的人們能夠使用。
對Uwanibe來說這一天來得還不夠快，她說「這一天我希望我們能更儘早的實現。」
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/d41586-019-00601-3
製版人：珂
參考文獻：
1. Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, Essletzbichler P, Dy AJ, Joung J, Verdine V, Donghia N, Daringer NM, Freije CA et al: Nucleic Acid Detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. SCIENCE 2017, 356,438-442.
2. Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F: Multiplexed and Portable Nucleic Acid Detection Platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. SCIENCE 2018, 360,439-444.
3. Chen JS, Ma E, Harrington LB, Da CM, Tian X, Palefsky JM, Doudna JA: CRISPR-Cas12a Target Binding Unleashes Indiscriminate Single-Stranded DNase Activity. SCIENCE 2018, 360,436-439.
4. Harrington LB, Burstein D, Chen JS, Paez-Espino D, Ma E, Witte IP, Cofsky JC, Kyrpides NC, Banfield JF, Doudna JA: Programmed DNA Destruction by Miniature CRISPR-Cas14 Enzymes. SCIENCE 2018, 362,839-842.
5. Liu JJ, Orlova N, Oakes BL, Ma E, Spinner HB, Baney K, Chuck J, Tan D, Knott GJ, Harrington LB et al: CasX Enzymes Comprise a Distinct Family of RNA-guided Genome Editors. NATURE 2019, 566,218-223.
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