前言

據統計，全球大約有15%的人會購買美白產品，其中亞洲佔主導地位。

全球行業分析師預測，受亞洲地區特別是印度、日本和中國新市場的推動，到2020年，美白產品的全球市場預計將達到230億美元。

根據siona biochem的報告，2010年以來，亞太地區的人們在護膚品和彩妝品上的花費約為130億美元。僅在印度就有4.32億美元花費在美白產品和其他護膚品上。

而最近的一項調查也顯示，約有80%的印度男性有使用美白膏的習慣，且印度每年使用美白膏的消費者的數量增長了18%。這些皮膚美白產品的作用機制主要是減少黑色素，而黑色素是決定皮膚顏色的主要來源。

黑色素是導致人類皮膚、眼睛和頭髮的色素沉著的主要因素，由表皮黑素細胞與基底角化細胞以1：36的比例產生。

在紫外線照射下，黑素細胞通過黑色素生成的過程合成黑色素。黑素體中合成的黑色素被運輸到表皮附近的角質形成細胞。在正常生理情況下，色素沉著對人體皮膚的光保護具有有益的作用，可抵禦有害的紫外線傷害，在偽裝和動物模擬方面也具有重要的進化作用。

然而，黑色素的過度分泌會導致皮膚疾病的出現，如雀斑、太陽黑斑（老年斑）和黑斑（6-9歲）以及炎症後黑皮病。此外，持續的紫外線照射會導致DNA損傷、基因突變、癌症、免疫系統受損和光老化。

黑色素形成調控機制

黑色素生成是一個複雜的途徑，涉及酶和化學催化反應之間的組合。黑素細胞產生兩種類型的黑色素：真黑素(棕黑)和褐黑素(紅黃)，由半胱氨酸或谷胱甘肽結合形成。

圖1 黑色素生成途徑（點擊看大圖）

黑色素生成過程是由L-酪氨酸通過關鍵酶-酪氨酸酶（TYR）氧化成多巴醌（DQ）開始的。DQ的形成是黑色素合成中的一個限速步驟，因為反應其他步驟可以在生理pH值下自發進行。

DQ形成後，經過分子內環化，產生吲哚、白色多巴產物（環多巴）。環多巴和DQ之間的氧化還原產生多巴色素和L-3,4-二羥苯丙氨酸（L-DOPA），也是TYR的底物，再被酶氧化成DQ。多巴色素逐漸分解為二羥吲哚（DHI）和二羥吲哚-2-羧酸（DHICA）。後一個過程由TRP-2催化，也稱為多巴色素異構酶（DCT）。

最終，這些二羥基吲哚（DHI和DHICA）被氧化成真黑色素。TRP-1被認為可以催化DHICA氧化生成真黑色素。

同時，DQ在半胱氨酸或谷胱甘肽存在下被轉化為5-s-半胱氨酸多巴或谷胱甘肽多巴。隨後的氧化產生了苯並噻嗪中間體，最後產生了褐黑素。儘管TYR，TRP-1和TRP-2這三種酶都參與黑素生成途徑，但TYR纔是黑素生成的唯一必需酶。

酪氨酸酶在黑色素合成中的關鍵作用

酪氨酸酶（單酚或二酚，氧化還原酶，EC1.14.18.1，syn.polyphenol氧化酶）是一種位於黑素體的膜內，結合的3型多功能含銅糖蛋白。酪氨酸酶僅由黑素細胞產生，它在內質網和高爾基體內產生並加工後，轉運到黑素小體，在黑小素體中合成為黑色素。從結構上看，兩個銅離子被三個負責酪氨酸酶催化活性的組氨酸殘基包圍（圖2）。活性部位有三種狀態：氧化、氨基化和脫氧形成色素沉著。

更具體地說，在活性位點，兩個銅離子與分子氧發生相互作用，形成一種高反應性的化學中間體，直接參與單酚對二酚的羥基化（單酚酶活性）和ο-二酚對鄰苯醌的氧化（二酚酶活性）。

酪氨酸酶還參與催化神經黑素的產生過程中，將多巴胺的氧化產生多巴醌。然而，多巴醌的過量產生會導致神經元損傷和細胞死亡，這表明酪氨酸酶可能在人類大腦神經黑色素的形成中發揮重要作用，並與帕金森病和亨廷頓病相關的神經退行性變有關。

酪氨酸酶還與果蔬採後和處理過程中的褐變有關。酪氨酸酶在昆蟲蛻皮過程中也有進一步的作用。

因此，通過抑制酪氨酸酶來調節黑色素合成是防止色素沉著的主要方式。

圖2 酪氨酸酶高分辨晶體結構

酪氨酸酶抑製劑

因為酪氨酸酶是通過黑素細胞生成黑色素的關鍵酶，因此直接抑制酪氨酸酶催化活性是最突出、最有效的靶點。市面上大多數化妝品或美白劑都是採用酪氨酸酶抑製劑。

由於酪氨酸酶僅由黑素細胞產生，所以靶向酪氨酸酶的抑製劑可以特異性抑制細胞內的黑素生成而無副作用。許多酪氨酸酶抑製劑如對苯二酚（HQ）、熊果苷、曲酸、壬二酸、L-抗壞血酸、鞣花酸、氨甲環酸等已被用作美白劑，但也存在一定的缺點（圖3）。

圖3 各種抑制酪氨酸酶活性美白劑的化學結構

對苯二酚（HQ）除了可以誘變哺乳動物細胞，還有一些不良反應包括接觸性皮炎、過敏、暫時性紅斑，灼燒，刺痛感，白斑病，慄點指甲，色素不足和褐黃病。

熊果苷，一種對苯二酚的前體藥物，是一種天然成分，減少或抑制酪氨酸酶活性從而抑制合成黑色素。然而，熊果苷的天然形態在化學上是不穩定的，可釋放對苯二酚，分解為含苯代謝物，對骨髓具有潛在的毒性。

由於曲酸的致癌性和貯存過程中的不穩定性，其在化妝品中的應用受到限制；L-抗壞血酸對熱敏感，易變質；鞣花酸不溶於水，因此生物可利用性差，而對氨甲環酸而言，其抑制黑素生成途徑仍未確定。

因此，迫切需要開發具有藥物性質的新型酪氨酸酶抑製劑。

本綜述整理了近年來直接參與酪氨酸酶催化活性和功能抑制的酪氨酸酶抑製劑的研究進展，包括實驗室合成方法、天然來源、虛擬篩選和基於結構的分子對接研究。

在本綜述中，抑製劑評價主要分為蘑菇酪氨酸酶類和人酪氨酸酶類兩大類，並根據其化學功能進一步分類（圖4），我們認為這一觀點將為研究者提供黑色素生成抑製劑的累積證據，並進一步瞭解抗黑色素生成化學方法。

圖4 酪氨酸酶抑製劑的分類

01 蘑菇酪氨酸酶抑製劑

蘑菇雙孢菇酪氨酸酶是一種以酪氨酸酶為靶點的皮膚美白物質，常被用作體外酶學模型。由於蘑菇酪氨酸酶(mTAR)的商業可利用性，大多數研究都是用這種酶來操作的。

在化合物的篩選中，常用的美白劑如曲酸、熊果苷、對苯二酚等會被作為陽性對照。因此，近年來，從天然和合成來源中發現了許多蘑菇酪氨酸酶抑製劑。

抑制強度用IC50值表示，IC50值是在試驗條件下抑制一半酶活性所需的抑製劑濃度。Ki值反映了配體與酶的結合親和力。Ki值越低表示結合親和力越高，而Ki值越高表示結合親和力越低。非競爭性抑製劑的Ki值基本上與抑製劑的IC50相同，而競爭性抑製劑的Ki值大約是IC50數值的一半。

在體外分析中，通常使用B16細胞，因為B16細胞比較容易在體外培養，並且與正常人類黑素細胞的黑素形成機制相同。

02 查爾酮和黃酮類酪氨酸酶抑製劑

查爾酮是一類廣泛分佈於水果、蔬菜、香料、茶葉、大豆等食品中的天然成分，對具有不同生物活性的酪氨酸酶有抑制作用。研究者合成了一系列新的4-（苯基脲基）查爾酮(1)衍生物，並且評估了它們對香蕉酪氨酸酶二苯酚酶活性的抑制作用（圖5(a)，1a-1j）。

圖五 (a)查爾酮抑製劑的化學結構，1a-1j，2a-2d，3a-3b，4a-4b，5a-5b和6a-6c

結果表明，化合物1a-1j對酪氨酸酶有抑制作用，尤其化合物1e和化合物1i能夠有效抑制酪氨酸酶活性，其IC50值分別為0.133μM和0.134μM。

此外，查爾酮這類成分的機理是競爭性抑制。在另一項研究中，以L-酪氨酸為底物，評價從南方桑屬中分離的查爾酮2a-2d對蘑菇酪氨酸酶的抑制活性。結果表明，與標準化合物熊果苷相比，這四種查爾酮衍生物都是非常有效的的酪氨酸酶抑製劑（圖5(a)，2a-2d）。特別的是，與熊果苷相比，化合物2a具有700倍的有效抑制作用。

構效關係（Structure–Activity Relation-ship，簡稱SAR）分析表明，環A和環B的間苯二酚構建可能是強烈抑制酪氨酸酶的原因。此外，環A的3號位的取代在增強抑制效力中也起著重要作用。例如，與未取代基的化合物2a相比，化合物2c上環A的空間尺寸比較大的取代基降低了抑制效力，這是由於該結構有利於對銅離子的螯合。

有趣的是，化合物2d表現出比化合物2a和化合物2c更強的抑制活性，表明在化合物2d的3』號位上的4-羥基-1-戊烯基團是增強其抑制作用的原因。此外，在產生黑色素的B16鼠黑素瘤細胞中測試了查爾酮對黑色素合成的影響，化合物2a、2b和2d有強烈的抑制效果，並且幾乎沒有細胞毒性。

最近，Radhakrishnan等人研究了以L-DOPA作為底物，氮雜查爾酮系列物對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用。在該研究中研究的化合物，發現兩種化合物3a和化合物3b，即吡啶基氮吖嗪的同源物（羰基還原），是比曲酸更強的酪氨酸酶抑製劑（IC50=27.30μM）（圖5(a)，3a-3b）。

此外，動力學分析發現化合物3a和化合物3b都是競爭性抑製劑，Ki值分別為2.62μM和8.10μM。結構功能分析表明，酪氨酸酶抑製劑吡啶骨架中的氮原子可與酪氨酸酶活性位點中存在的銅離子絡合。

同一研究小組研究了另一種具有肟功能的查爾酮系列，作為黑色素瘤B16細胞中酪氨酸酶和黑色素形成的抑製劑。兩種化合物（4a：IC50=4.77μM和4b：IC50=7.89μM）顯示出比曲酸（IC50=22.25μM）更強的酪氨酸酶抑制活性(圖5(a)，4a-4b)。

據動力學研究顯示，這兩種競爭性抑製劑的Ki值分別為5.25μM和8.33μM。在促黑素細胞刺激激素（α-Melanocyte-Stimulating Hormone，簡稱α-MSH）誘導的B16黑素瘤細胞中，這兩種化合物4a和4b抑制黑色素形成和酪氨酸酶的活性，且沒有細胞毒性。在SAR分析方面，發現鄰甲氧基與對硝基取代基（環B）的存在是有效的酪氨酸酶抑制的原因（4a）。此外，給電子對二甲基氨基環（環B）表現出第二最有效的抑制作用（4b）。

在另一項研究中，報告了一系列新的2,3-二氫-1H-茚-1-酮查爾酮樣衍生物。其中兩個，化合物5a和化合物5b，被鑒定為酪氨酸酶的二酚酶活性的有效抑製劑，IC50值為12.3μM和8.2μM（圖5(a)）。進一步探索該機制，發現抑製劑5a和5b都是可逆性競爭抑制。

Wang等從菲律賓蔓性千斤撥中分離出二氫查爾酮（圖5(a)，6a-6c）和黃烷酮（圖5(b)，7a-7c），並研究了它們對酪氨酸酶的抑制活性。結果表明，它們具有抑制酪氨酸酶的單酚酶（IC50=1.01μM~18.4μM）和二酚酶（IC50=5.22μM~84.1μM）的作用。特別是二氫查耳酮(6c)，能有效地抑制酪氨酸酶的單酚酶和二酚酶的活性，IC50值分別為1.28μM和5.22μM。

SAR分析非常有趣，因為藥效基團與酪氨酸酶抑制無關，並且缺乏大多數抑製劑中存在的α，β-不飽和酮基序。以黃烷酮為例，表明含有間苯二酚基團(7a)的化合物具有競爭性並顯著抑制酪氨酸酶的單酚酶(IC50=1.79μM)和二酚酶(IC50=7.48μM)。

在尋找新的酪氨酸酶抑製劑的過程中，發現毛杭子梢提取物顯示出對酪氨酸酶有抑制的作用。在成功分離和純化14種化合物後，四種化合物（圖5(b)，8a-8d）顯示出對酪氨酸酶有強效抑制活性。

結果表明，大葉千斤撥（即化合物8c）對酪氨酸酶的單酚酶和二酚酶活性的抑制作用最大，其IC50值分別為30nM和500nM。此外，與曲酸（13.2μM）相比，化合物8c對酪氨酸酶的單酚酶活性的抑制效果高400倍。第二種最有效的化合物是香葉素化的異黃烷酮（即化合物8a）能抑制單酚酶和二酚酶的活性，其IC50值分別為2.9μM和128.2μM，並被鑒定為競爭性和可逆的抑製劑。此外，化合物8a和8c能有效降低α-MHS誘導的B16黑素瘤細胞中的黑色素含量，而不影響細胞活力。從結構上來看，香葉基側鏈上取代基的減少提高了酪氨酸酶的抑制活性。

圖5(b) 黃烷酮抑製劑的化學結構：7a-7c和8a-8d

03 白藜蘆醇衍生物

白藜蘆醇（3,5,4-三羥基-反式-二苯乙烯，化合物9），是一種廣泛分佈的天然甾體，例如存在於葡萄中，通過Kcat（自殺基質）類型抑制的機制，它表現出對蘑菇酪氨酸酶的抑制活性。在α-MSH刺激的B16小鼠黑色素瘤細胞中進行體外分析中，白藜蘆醇通過抑制黑素生成相關蛋白如酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和小葉丘腦相關轉錄因子Microphthalmia-associated Transcription Facto,（簡稱MITF）的表達來抑制細胞黑色素生成。細胞毒性可達200μM。

白藜蘆醇的抑制作用已在使用UVB照射的褐色豚鼠的體內模型中得到了證實。在這項研究中，用白藜蘆醇治療被UVB照射過的豚鼠背部皮膚，在視覺上是能減少了色素過度沉著的。

圖6 白藜蘆醇及其衍生物：10a-10f，11a-11e，12a-12d和13a-13g

*根據參考文獻，白藜蘆醇的IC50值為26.63±0.55μM和57.05μg/mL

為了提高白藜蘆醇的活性，Fenco等人用一系列白藜蘆醇類似物進行了研究（圖6,10a-10f），其中一個-CH基團被氮原子取代了。在測試的類似物中，4-甲氧基(10a)、4-羥基(10d)或2-羥基(10e)取代的化合物顯示出更高的有效抑制作用，表明氮原子對鹼性白藜蘆醇結構的改變能導致酪氨酸酶抑制作用的增強。

此外，還發現對位(10d)的羥基對其抑制效力也很重要。在另一項研究中，Bae等人設計、合成並評價了一系列(E)-N-取代的亞苄基-羥基或甲氧基-苯胺衍生物(氮雜-白藜蘆醇型)對酪氨酸酶活性的抑制作用(圖6,11a-11e)。具有4-甲氧基-或4-羥基-苯胺基的衍生物(11a-11d)顯示出比2-羥基苯胺基(11e)更強的對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用。(E)-4-((4-羥基苯基亞氨基)甲基)苯-1,2-二醇(11c)對蘑菇酪氨酸酶顯示出最有效和非競爭性的抑制，顯示IC50值為17.22μM，並且比曲酸(51.1μM)有效。化合物11a和11c-11e被鑒定為非競爭性抑製劑，而化合物11b屬於競爭性抑製劑。

本研究通過合成一系列(E)-2-((取代苯基)二苯乙烯基)苯基-4-甲基苯磺酸鹽(12a-b)和(E)-2-((取代苯基)二氮烯基)苯酚衍生物(12c-d)進一步拓展研究(圖6)，表示大部分化合物對酪氨酸酶具有強烈的劑量依賴性抑制作用。特別地是，新化合物(E)-2-((2,4-二羥基苯基)二氮烯基)苯基-4-甲基苯磺酸鹽(12b)顯示出最佳抑制結果，IC50值為17.85μM。使用L-酪氨酸作為底物的Lineweaver-Burk雙倒數圖測定表明化合物12b作為一種競爭性抑製劑。此外，化合物12a-12d還能抑制小鼠B16F10黑素瘤細胞中的酪氨酸酶活性和黑色素合成。

最近，報告了一系列偶氮-白藜蘆醇(13a-13e和13g)和偶氮-氧化白藜蘆醇(13f)(圖6)。在這些化合物中，化合物13a和化合物13b濃度在50μM時，對酪氨酸酶抑制活性分別為56.25％和72.75％。結果發現，4-羥基苯基對酪氨酸酶的抑制作用較強，3,5-二羥基苯基或3,5-二甲氧基苯基衍生物表現出對酪氨酸酶的抑制作用優於2,5-二甲氧基苯基衍生物。特別是在4-羥基苯基中引入羥基或甲氧基後，蘑菇酪氨酸酶的抑制作用減弱且明顯減弱。在合成的偶氮化合物中，偶氮-白藜蘆醇(13b)對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用是最強的，其IC50值為36.28μM。結果表明，偶氮白藜蘆醇具有較高的Log ρ值，用在開發增白劑和藥物治療色素沉著方面應該優於白藜蘆醇。

04 香豆素衍生物

香豆素屬於苯並吡喃酮化合物的大家族，來源由天然和合成的，具有不同的藥理活性。在最近的研究中，很少量的香豆素就被證明可以抑制蘑菇酪氨酸酶，其中還發現七葉皁苷和傘形酮抑制酪氨酸酶活性的能力更強。在經過Matos等人的不斷努力中，已經研究了一系列香豆素-雌激素-對照雜化化合物，3-苯基香豆素在支架的不同位置發生羥基或烷氧基和溴取代基(圖7)。在該系列中，在3-苯基香豆素結構(化合物14)中具有溴原子和兩個羥基的化合物被鑒定為最佳酪氨酸酶抑製劑，其IC50值為215μM。該化合物是非競爭性酪氨酸酶抑製劑，Ki值為0.189mM。

圖7 香豆素衍生物的化學結構：14，15a-15b，16a-16d和17a-17d

在另一項研究中，研究了一系列傘形酮類似物對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用。具體來說，是具有3,4-二羥基和3,4,5-二羥基苯基支架的化合物15a和15b顯示出對蘑菇酪氨酸酶活性更有效的抑制活性(圖7)。

Asthana等人證明瞭一系列羥基香豆素(16a-16d)(圖7)。SAR研究表明，香豆素上羥基取代基的位置在酶抑制中起作用；具有芳香族羥基化的化合物6-羥基香豆素(16c)和7-羥基香豆素(16d)被發現是酶的底物。特別是，7-羥基香豆素濃度在0.3mM-0.9mM的範圍內能強烈抑制多巴色素的活性。在7-羥基香豆素最大濃度下，抑制率可達到88％。作者發現這種現象是由於L-酪氨酸轉化的特異性抑制而導致的。另一方面，具有吡喃酮羥基化，3-羥基香豆素(16a)和4-羥基香豆素(16b)的化合物不是酪氨酸酶的底物。發現3-羥基香豆素(16a)抑制酪氨酸酶而不是具有4-羥基香豆素(16b)的化合物，表明吡喃酮環不能被酪氨酸酶羥基化。

近年來，篩選了一系列硫代膦酸二醯胺的酪氨酸酶抑制活性。結果表明，C-5連接的取代基和兩個立體中心(C-5和磷原子)的立體化學對酪氨酸酶的抑制具有重要作用(化合物17a-17d)。具有未取代的苯基的非對映異構體對酪氨酸酶(17a和17a′)沒有顯示出任何抑制活性。相反，具有取代苯基的化合物顯示出對酪氨酸酶活性的各種影響。例如，化合物17b，對氯苯基化合物，對酪氨酸酶就有中度抑制作用（80.65%酪氨酸酶抑制效果），但對其非對映體17b′作用不明顯（16.5%酪氨酸酶抑制效果）。化合物17c（58.54%酪氨酸酶抑制效果）和17c′中含有對甲基苯基(61.80%酪氨酸酶抑制效果)表現出良好的酪氨酸酶抑制作用。發現化合物17d由2-吡啶基（97.40%酪氨酸酶抑制效果）片段組成，該片段是上述研究中最有效的酪氨酸酶抑製劑。

05 具有β-苯基-α,β-不飽和羰基功能的抑製劑

近年來，據研究稱，亞苄基乙內醯脲(化合物18a)，苄基-去甲吡咯烷二酮(化合物18b)和亞苄基噻唑烷-2,4-二酮(化合物18c)衍生物可作為潛在的酪氨酸酶抑製劑(圖8(a))。在體內研究實驗中，該類化合物被證明是一類有效的皮膚美白劑，因為它們表現出比曲酸和熊果苷還要強的抑制酪氨酸酶活性的能力。

事實上，化合物18a是通過代替酪氨酸酶底物（L-酪氨酸和L-多巴）的化學結構而設計的。SAR研究表明，化合物18a（乙內醯脲）的1號位上的醯胺(- NH )具有與酪氨酸酶活性位點的氨基酸形成氫鍵的能力。此外，化合物18a的亞氨基基團還可以替代底物的羧酸基團。

在此研究背景的基礎上，Kim等人，合成並評估了一系列具有β-苯基-α,β-不飽和羰基支架的5-(羥基/烷氧基取代的亞苄基)硫代乙內醯脲衍生物。其中，三種化合物19a-19c表現出比曲酸或白藜蘆醇高的抑制活性(圖8(a))。特別的是，他們發現2,4-二羥基亞苄基-2-硫代乙內醯脲，即化合物19c（IC 50 = 1.07 μM）是本研究實驗中的最佳抑製劑。此外，化合物19c具有抑制B16細胞中的酪氨酸酶的活性，且沒有任何顯著的細胞毒性。

圖8 (a).具有β-苯基-α，β-不飽和羰基官能團的抑製劑的化學結構：18a-18c，19a-19c，20a-20c，21a-21b，22a-22c

在繼續研究的過程中，他們合成了具有線性β-苯基-α、β-不飽和羰基支架的化合物(E)-2-苯甲醯基-3-(取代苯基)丙烯腈（一種BPA衍生物），並且評價其為潛在的酪氨酸酶抑製劑。其中，發現20a-20c這三種化合物能有效地抑制蘑菇酪氨酸酶的活性(圖8(a))。特別是化合物20c能明顯抑制黑色素的合成，抑制B16細胞內酪氨酸酶活性而不影響細胞的活力。SAR分析顯示，以上所有活性化合物在苯環上具有4-羥基，並且發現在3位或3、5位的Br取代與強效酪氨酸酶抑制活性有關。

最近，同一研究小組繼續探索3-(取代苯基)丙烯腈的構效關係，發現一系列具有線性β-苯基-α，β-不飽和羰基支架的(E)-2-氰基-3-(取代苯基)丙烯醯胺衍生物顯示出對蘑菇酪氨酸酶的抑制活性。在這些化合物中，化合物21a和化合物21b對蘑菇酪氨酸酶具有抑制活性(圖8(a))。特別是化合物21a顯示出優異的抑制活性。在B16細胞中，化合物21a以劑量依賴性方式顯著抑制酪氨酸酶活性，而沒有任何細胞毒性作用的影響。從結構的角度來看，「線性」β-苯基-α，β-不飽和羰基支架通過直接抑制酪氨酸酶活性而顯示出抗黑素生成的作用，起著重要作用。

人們早就知道肉桂醛能夠抑制蘑菇酪氨酸酶對L-多巴的氧化。最近，Cui等人研究了一系列肉桂醛衍生物的α-取代衍生物。經SAR研究表明，α-溴肉桂醛(化合物22a)，氯苄甲醛(化合物22b)和α-甲基肉桂醛(化合物22c)降低了酪氨酸酶的單酚酶和二酚酶的活性(圖8(a))。化合物22a-22c的IC50值在單酚酶上分別為0.075 mM、0.140 mM和0.440 mM，在二苯酚酶上分別為0.049 mM、0.110 mM和0.450 mM。此外，有人提出，與肉桂醛相比，α-取代的肉桂醛衍生物更有效。

圖8 (b).具有β-苯基-α，β-不飽和羰基官能團的抑製劑的化學結構：23a-23b和23c-23g

近年來，硫代/巴比妥酸鹽在酪氨酸酶抑製劑領域引起了關注，因為它們具有吸引人的結構單元「β-苯基-α，β-不飽和羰基支架」，其具有抑制酪氨酸酶的功能。在相關文獻中表示，少數在苯環的4-位具有羥基取代基的5-亞苄基（硫代）巴比妥酸鹽具有優異的抑制活性，例如，化合物23a和化合物23b的抑制濃度IC 50值分別為13.98 μM和14.49 μM(圖8(b))。

受到這項工作的啟發，Chen等人也研究了硫/巴比妥酸鹽的構效關係，強調羥取代基的位置和數量對酪氨酸酶抑制活性有影響。於是，他們研究出了一系列羥基/甲氧基取代的5-亞苄基（硫代）巴比妥酸鹽對蘑菇酪氨酸酶的二酚酶活性具有明顯抑制作用。結果表明，與曲酸相比，化合物(23c-23g)具有有效的酪氨酸酶抑制活性(IC 50 = 18.25 μM)。特別是，具有3,4-二羥基取代基的化合物23e被認為是最佳抑製劑，其IC50值為1.52 μM。經SAR研究表明，巴比妥類藥物的藥效優於硫代巴比妥類藥物，苯環上3,4-二羥基使其作用增強。此外，這些抑製劑被發現是可逆的。

06 硫脲衍生物

苯硫脲（Phenylthiourea，簡稱PTU）是最著名的酪氨酸酶抑製劑之一。PTU的硫原子與酪氨酸酶活性位點的兩個銅離子結合，阻斷了酶的活性。

Jung等人最近對蘑菇酪氨酸酶PTU衍生物的SAR進行了研究。雖然PTU衍生物可以有效抑制B16黑素瘤細胞的黑素生成，但後來進一步被歸因於酪氨酸酶活性受到抑制。經SAR的研究，強調了化合物的結構對酪氨酸酶抑制和殺菌作用的影響(圖9(a))：

圖9 （a）硫脲衍生物的化學結構：24a-24f，25a-25b和26a-26e

（i）將p-平面結構直接連接到硫脲（如24a-24b）；

（ii）苯環的對位或間位的疏水取代基易被取代（如24c-24d），鄰位取代基不易被取代（如24e），表明C2-取代的苯基可能阻礙在酪氨酸酶活性位點含有銅離子的硫脲的複合物的形成；

（iii）另外，遊離的3-氨基氫對酪氨酸酶的抑制很重要，但對B16細胞的黑色素生成抑制作用不明顯，1,3-二取代衍生物對黑色素的生成表現出更大的抑制能力（如24f）。

這些研究表明，1,3-二取代衍生物通過不同於酪氨酸酶催化活性的途徑來阻止黑色素生成。1-苯基硫脲和1,3-二苯基硫脲的分子對接分析表明，平面苯基與硫脲單元和遊離3-NH2的直接連接是影響酪氨酸酶活性的先決條件（如圖10）。

圖10 化合物24d（棒模型）的對接姿勢顯示了來自巨大芽孢桿菌（PDB ID：3NQ1）的酪氨酸酶的兩個銅離子（球形表示）和結合袋（表面模型）。

另一方面，Crinton等報道了一系列N-羥基-N-苯脲衍生物，在PTU中用氧取代硫，用N-羥胺取代3-NH2。結果表明，所報道的衍生物均具有比PTU更強的藥效，特別是N-羥基-N-苯脲(化合物25a)的藥效是PTU的6倍。而N-羥基-N-苯硫脲(化合物25b)衍生物無抑制作用，說明N-羥基脲的螯合能力纔是抑制酪氨酸酶的重要因素(圖9(a))。

除了人工合成和天然來源，「篩選」是另一種尋找新抑製劑的替代策略。對許多生物學靶標而言，通過篩選獲得臨牀批准的藥物數量已經不斷增加。與現有藥物相關的數據相結合，將減少開發新型藥物的時間和成本。這種方法有幾個優點，包括可用性強、成本低和安全性/耐受性高。PTU長期以來被認為是酪氨酸酶抑製劑。通過基於配體的虛擬或HTS篩選,進行化學相似性分析，確定乙硫醯胺(化合物26a)及其衍生物(化合物26c-26e)為酪氨酸酶抑製劑，其中包括丙硫醯胺(化合物26b)(圖9(a))。

乙硫醯胺是一種被批准用於治療耐多葯結核病的二線抗結核藥物。而其結構類似物、一線抗結核藥物異煙肼對酪氨酸酶的抑制效果都較差。在B16細胞中，抑製劑吡啶-2-碳硫醯胺和硫苯醯胺分別顯著降低黑色素含量，抑制率分別為44%和37%。乙硫醯胺是一種被批准用於治療耐多葯結核病的二線抗結核藥物。而結構類似物、一線抗結核藥物異煙肼對酪氨酸酶的抑制效果都較差。在B16細胞中，抑製劑吡啶-2-碳硫醯胺和硫苯醯胺分別顯著降低黑色素含量，降低率分別為44%和37%。經過廣泛的結構分析，由結構與活性分析（SAR）的數據表明，硫代甲醯胺是開發新的有效的酪氨酸酶抑製劑的核心部分。

圖9 （b）硫脲衍生物的化學結構：27a-27e，28a-28d，29a-29d和30a-30b

在最近的一項研究中，研究人員在臨牀中-測試了硫脲衍生藥物，並通過酶和細胞實驗研究了它們對酪氨酸酶活性的影響。觀察到甲狀腺藥物甲巰咪唑（化合物27a）、卡馬西唑（化合物27b）、硫脲嘧啶（化合物27c）、甲基硫脲嘧啶（化合物27d）、丙基脲嘧啶（化合物27e）對蘑菇酪氨酸酶有抑制作用(圖9(b))。此外，動力學研究指出含有硫脲的藥物的作用機理是非競爭性抑制。而SAR的數據研究也表明硫脲本身呈濃度依賴的方式抑制酪氨酸酶的活性。這說明硫脲衍生物的抑制活性必須來源於硫原子和氮原子。

07 縮胺基硫脲衍生物抑製劑

縮氨基硫脲由於其經典的結構特點和在酪氨酸酶活性位點螯合銅離子的能力而成為酪氨酸酶抑製劑的主要類別之一。

近來，據研究報道，不同研究組的大多數縮氨基硫脲都被認為是有效的酪氨酸酶抑製劑。經SAR數據研究表明，氨基硫脲支架能夠有效地與酪氨酸酶活性位點的兩個銅離子結合，這是抑制酪氨酸酶活性的關鍵。為改善其活性，研究組又研究了一系列4/3-氨基苯乙酮及其衍生物的縮氨基脲區域對蘑菇酪氨酸酶活性的抑制作用。根據生物實驗的結果來看，醯胺基化合物（31a-31g，圖11）表現出強大的酪氨酸酶抑製劑活性，甚至超過了曲酸（IC 50 = 28.5 μM）。相比之下，氨基苯酮（31h和31i）顯示出激活酪氨酸酶的活性，而且發現化合物31d是最活躍的化合物，IC 50值為0.291 μM。經SAR數據分析研究還發現，氨基硫脲基團對酪氨酸酶活性的抑制作用非常重要，而醯基對酪氨酸酶抑制活性的增強至關重要，苯環4位的醯基胺取代基能提高酪氨酸酶活性的抑制能力。此外，經酪氨酸酶抑制機制和動力學研究表明，化合物31a是一種可逆的非競爭性抑製劑。

圖11 縮氨基硫脲類似物31a-31i和32a-32i的化學結構

在繼續尋找有效的化合物作為高效酪氨酸酶抑製劑的過程中， 研究人員在進行硫代-微卡巴腙化合物的SAR數據分析時，合成了一系列新的4-烷氧基和4-醯氧基苯基乙烯基硫代氨基脲衍生物(32a-32i，圖11)，並對其進行了酪氨酸酶抑制活性的評估。結果表明，其中大多數抑製劑對酪氨酸酶的活性具有顯著的抑制作用，其IC 50值均低於1.0 μM。特別是化合物32d與其他衍生物相比，具有顯著的酪氨酸酶抑制作用。經SAR數據分析研究表明，縮氨基硫脲基團在決定酪氨酸酶活性抑制的中起著關鍵作用。苯環與縮氨基硫脲基團（化合物32f-g）之間亞甲基連接基的長度對酪氨酸酶活性的抑制效果沒有影響。而硫代羰基醯肼基團（化合物32h-32i）的引入不利於酪氨酸酶活性的抑制。

08 肽衍生物抑製劑

為了發現新的酪氨酸酶抑製劑，近年來研究人員已經注意到肽序列可以抑制酪氨酸酶的活性。目前已經研究過了幾種酪氨酸酶抑制肽，例如二肽、環肽、短序列寡肽和曲酸三肽化合物。特別是寡肽已被證明是有效的酪氨酸酶抑製劑。兩個寡肽P3，一個八肽(Ar-Ala-Asp-ser-Arg-Ala-Asp-Cys)和一個十肽P4(Tyr-Arg-ser-Arg-Lys-Tyr-Ser-Ser-Trp-Tyr)，與對苯二酚相比，對蘑菇和人體酪氨酸酶的活性具有更強的抑制作用，其IC 50值分別為123 μM和40 μM，而且這些寡肽對黑素細胞都沒有細胞毒性。在成功配製成局部乳膏並獲得有效的臨牀效果後，十肽P4（也稱為十肽-12）已被用作亮膚產品中的主要活性成分。

在最近的一項研究中，Hsiao等人發現了二肽化合物(A5)和三肽RCY和CRY能有效抑制酪氨酸酶的活性。特別是新型三肽CRY顯示出對蘑菇酪氨酸酶活性有最顯著的抑制效力(IC 50 = 6.16 μM)。這種三肽比已知的寡肽更有效，抑制酪氨酸酶活性的能力可以與曲酸三胜肽相當。三肽CRY和RCY利用半胱氨酸殘基的硫醇基團與酪氨酸酶活性位點的銅離子配位，從而使酪氨酸酶的活性降低。在另一項研究中，半胱氨酸雙肽曾被報告稱，可以有效地抑制酪氨酸酶的活性。作者認為，這些含半胱氨酸的二肽可能是由於能直接阻斷酪氨酸酶的活性位點，從而產生有效的抑制作用。特別的是，含有N-末端胱氨酸的二肽明顯優於C-末端含有半胱氨酸的二肽，二肽CE，CS，CY和CW顯示出比較的生物活性，而含酪氨酸的二肽是底物樣抑製劑。此外，這些二肽在黑素細胞中沒有顯示出顯著的細胞毒性，而且二肽CA和PD在濃度1 μM時，可減少5.6%和16.5%黑色素含量（詳細見表1）[後面的數據咋能一模一樣呢]。

表1. 二肽對黑素細胞中黑色素含量的抑制

Li等人，從曲酸開始研究了一組羥基吡啶酮-L-苯丙氨酸軛化物（化合物33a和33b）(圖12)對酪氨酸酶的抑制活動。從對酪氨酸酶活性的評價實驗中表示，化合物(S)-(5-(苯氧基)-1-辛基-4-氧代-1,4-二氫吡啶-2-醯基)甲基2-氨基-3-苯基丙酸酯，化合物（33b）對單酚酶和二酚酶活性的抑制活性，IC50值分別為12.6μM和4.0μM。此外，這些結合物是混合型抑制，表明它們可以與遊離酶和酶底物的複合物相結合。

圖12 肽綴合物的化學結構，33a-33b，34和35

在另一項研究中，設計了羥基吡啶-L-氨基酸綴合物並評價了它們對蘑菇酪氨酸酶活性的抑制能力。在所研究的化合物中，僅有兩種化合物表現出了對單酚酶（化合物34，IC 50 = 1.95 μM；35，IC 50=2.79 μM）和二酚酶的抑制活性（化合物34，IC 50 = 8.97 μM；化合物35，IC 50 = 26.20 μM）(圖12)。此外，化合物34和化合物35被鑒定為可逆的混合型抑製劑。

09 各種蘑菇酪氨酸酶抑製劑

近年來，從天然來源中提取和分離的化合物作為酪氨酸酶抑製劑引起了廣泛關注，並被認為是常用的皮膚美白劑。為了尋找一種安全有效的美白物質，Chen等人從草本植物中篩選出了一些天然產物，並從天麻的根莖中分離並篩選出化合物36和化合物37，作為蘑菇酪氨酸酶抑製劑。

隨後的SAR數據分析研究已經識別出其類似化合物38-40(圖13)。雙(4-羥基苯苄基)硫醚36顯示出突出的對酪氨酸酶活性的抑制能力，其IC 50值為0.5 μM和Ki值為58 nM。通過醚鍵連接的化合物37顯示出抑制能力減少了713倍(IC 50 = 378.11 μM)，表明硫原子在與銅離子的螯合過程中發揮著重要作用，並且有助於提高的酪氨酸酶活性的抑制。

圖13 各種酪氨酸酶抑製劑36-40和41-43的化學結構

另一方面，縮短連接硫和苯環的碳鏈，可以使化合物38對酪氨酸酶活性有中度抑制作用。去除羥基，使化合物39對酪氨酸酶活性的抑制效果不佳，這就說明瞭兩個羥基有著重要的作用。而通過甲氧基取代，化合物36的衍生物的抑制效力降低（IC 50 = 40.02μM），這就說明氫鍵的相互作用優於甲醇鹽基團的疏水相互作用。

濃度為50 μM的化合物36在人的黑素細胞系統中降低了20%的黑色素含量，且對人體黑色素細胞沒有明顯的細胞毒性。此外，在斑馬魚體內實驗中也顯示化合物36能有效減少黑色素生成，且無不良影響。另外，急性口服毒性研究證實化合物36在小鼠體內無可識別的細胞毒性。因此來說，化合物36是一種可開發的、安全的、有效的美白劑的潛在成分。

最近，Ai等人使用虛擬篩選方法篩選了化學文庫，並將化合物41鑒定為一種有效的蘑菇酪氨酸酶抑製劑，其IC 50 = 8 μM，並以0.002%的濃度(相當於27.5μM)，在B16細胞中發生的黑色素生成過程中產生了29%±17.64%的抑制能力。

通過對化合物41的SAR數據分析研究，發現化合物41的B環的芳香基團對酪氨酸酶活性抑制的影響是必不可少的，由於環己基環取代了B環（化合物42b），取代B環便失去了對B16細胞黑色素合成的抑制。另一方面，A環上4號位的取代對酪氨酸酶活性抑制的影響是可以忽略的（見化合物42a-42d）。這些化合物具有劑量依賴性，可抑制B16細胞黑色素的合成。

然而，隨著對化合物41的進一步發展，發現了一個潛在的配方問題，於是就將其從化妝品的使用候選中被排除了。隨著對次級結構的進一步分析，確定了化合物43以0.001%的濃度（相當於33.6μM）在B16細胞中發生的黑色素合成過程中，起到79%±5.34%的抑制效果。化合物41和43這兩種化合物具有良好的生物化學性質，滿足Lipinski的「五行法則」，對B16細胞的黑色素合成也有明顯的抑制作用。這種黑色素合成抑製劑被證明不會影響細胞的生存能力，這也進一步強調了這些化合物的潛在商業用途。

據以往研究所知，從皮薩草中分離得到的香草醛和香草酸可以作為抗衰老的成分。基於此背景，本研究發表了苯甲酸、肉桂酸、哌嗪等一系列香草醛酯對酪氨酸酶活性具有抑制作用。結果表明，化合物44a-44d對蘑菇酪氨酸酶的活性有較好的抑制作用(圖14)。特別是44b表現出最強的抑制活性，IC 50值為16.13 μM。從結構上看，取代肉桂酸酯和羥基取代在酪氨酸酶的抑制中發揮了重要作用。動力學研究表明，化合物44b為可逆的、混合型的酪氨酸酶抑製劑（Ki = 13 μM和Ki 53 μM）。

在另一項研究中，發現2-羥基酪醇45（簡稱：2-HT）可抑制蘑菇酪氨酸酶的活性（IC 50 = 13.0μmol/L），與曲酸同樣有效（IC 50 = 14.8μmol/L）。此外，2-HT的劑量依賴性可以抑制B16黑色素瘤細胞的無細胞提取液中的酪氨酸酶的活性(IC 50 = 32.5 μmol/L)，和完整的黑色素瘤B16細胞中的a-MSH刺激的黑色素形成。據研究報告，甲巰咪唑(2-巰基-1-甲基咪唑)衍生物可以抑制蘑菇酪氨酸酶。2-巰基咪唑(46a)、巰基-1-甲基咪唑(46b)和3-甲基-2-硫雜亞苄基-2,3-二氫-1H-咪唑-1-羧酸叔丁酯(46c)顯示出對酪氨酸酶活性有明顯抑制作用，其IC 50值分別為4.11 mM、1.43 mM和1.45 mM(圖14)。動力學分析表明，化合物46a和化合物46b為競爭性酪氨酸酶抑製劑，化合物46c為非競爭性酪氨酸酶抑製劑。此外，在B16細胞的體外分析中，化合物46a-46c在不影響細胞毒性的情況下，對細胞內黑色素的產生有較強的抑制作用。

一系列三唑席夫鹼衍生物被證實了對蘑菇酪氨酸酶的活性有抑制作用。從生物學評價結果顯示，僅有三種化合物47a-47c表現出有效的抑制能力，它們的IC 50值分別為12.5 μM、7.0 μM和1.5 μM(圖14)。動力學分析顯示，這些化合物均為可逆的混合型抑製劑。動力學分析顯示，這些化合物均為可逆的混合型抑製劑。經過熒光猝滅和銅的相互作用的研究證實，這些抑製劑與酪氨酸酶的相互作用，且與活性部位的銅離子相互作用，具有螯合能力。從結構上看，苯環2號位的取代反應的活性（47c）優於3號位的取代反應的活性（47b）。還有研究了的一種新的胸腺素衍生物系列，包括羥基苯甲酸和肉桂酸，也可作為蘑菇酪氨酸酶抑製劑。一般來說，肉桂酸麝香草酚衍生物對酪氨酸酶的抑制能力比苯甲酸衍生物更好，以化合物48a（IC 50 = 15.20μM）與化合物48b（IC 50 = 91.5μM）的比較為例。

最近，研究了從高麗參(P. ginseng C.A. Mayer)的葉片中分離得到Picrionoside A（化合物49）的作用，結果表明其對蘑菇酪氨酸酶活性具有抑制作用，IC 50值為9.8 μM，比曲酸和熊果苷的抑制能力強了6.8~10倍(圖14)。在黑色素-Ab細胞中，化合物49在不影響細胞存活的情況下，以劑量依賴性的方式能減少了17.1%的黑色素含量的生成。

此外，Picrionoside A處理的斑馬魚對機體色素沉著有顯著的抑制作用。綜上所述，Picrionoside A可能是一種有效的皮膚美白劑。在篩選比色鏈黴菌（Streptomyces bikiniensis）中的黑素生成抑製劑的過程中，發現S-(-)-10,11-二羥基法尼酸甲酯（dhFAME，化合物50），是一種由球孢白僵菌CS1029產生的昆蟲幼蟲激素，能直接抑制酪氨酸酶的活性。此外，化合物50能顯著降低了黑色素含量的生成，抑制細胞中酪氨酸酶的活性以及黑素-a細胞中cAMP水平的胞內積累，但不誘導細胞增殖。

通過基於結構的虛擬篩選預測方法，鑒定出了一類新的強效的酪氨酸酶抑製劑。以蘑菇酪氨酸酶（PDB ID: 2Y9X）的結構作為模板，進行分子動力學（Molecular Dynamics，MD）模擬。最初，生成了使用分子動力學模擬的10000個結構的集合體。經過隨後的篩選，得到了前61個具有選擇性抑制的分子，並用來評估其對蘑菇酪氨酸酶活性的抑制，如圖14所示（51a-51e）。結果表明，三唑和四唑的分子結構能夠結合酪氨酸酶催化中心的兩個銅離子。尤其是四唑類化合物（51b），具有最強的活性。

作者發現，許多化合物在B16黑色素瘤細胞中能夠減少黑色素的生成，而且沒有細胞毒性。具體來說，含有縮氨基硫脲的化合物51e能使黑色素含量降低55%。該結果為3型-銅酶功能的調控提供了有價值的見解。

圖14 各種酪氨酸酶抑製劑的化學結構：44a-44c，45，46a-46c，47a-47c，48a-48b，49，50，51a-51e和52。

卡託普利（[2S]- N -[3-巰基-2-甲基丙酸]- l -脯氨酸）是一種血管緊張素轉換酶抑製劑，廣泛應用於高血壓和心力衰竭的治療。為了鑒別新型的、有效的酪氨酸酶抑製劑，卡託普利（化合物52）的抑製劑效應被試驗用於酪氨酸酶抑制活性的抑制。結果表明，化合物52對酪氨酸酶活性有抑制作用，IC 50值為590 μg/mL (如圖14)。在B16細胞的進一步體外研究中，化合物52被發現以劑量依賴性的方式抑制酪氨酸酶的活性，從而抑制了黑色素的形成，且不產生細胞毒性。

10 人體酪氨酸酶抑製劑

儘管可以獲得大量的酪氨酸酶抑製劑，並且其中幾種也具有有效的抑制活性，但是幾乎所有的抑製劑都是針對蘑菇酪氨酸酶進行評價的。為了找到針對人的酪氨酸酶的新型抑製劑，Yoshimori等人證明瞭歐側柏酚（thujaplicins）（52-54；α，β，γ異構體，圖15）對蘑菇酪氨酸酶和人酪氨酸酶(hTYR)抑制作用的比較。結果表明，β-異構體和γ-異構體的歐側柏酚（化合物53和54）對人的酪氨酸酶活性的抑制作用呈劑量相關性，IC 50值分別為8.98 μM和1.15 μM。尤其是γ-異構體的歐側柏酚（化合物54）大大優於曲酸(IC 50 = 17 μM)。經SAR數據分析研究顯示，異丙基在託酚酮支架上的位置是決定歐側柏酚抑制酪氨酸酶效力的決定因素。歐側柏酚的抑制效力按以下順序排列：γ > β > α-歐側柏酚。

研究人員進一步評估了歐柏側酚對蘑菇酪氨酸酶抑制活性的影響，並與hTYR的抑制活性進行了比較。結果表明，歐柏側酚對hTYR和mTYR的抑制活性存在較大差異：曲酸對hTYR的抑制能力比對mTYR弱了10.64倍。在歐側柏酚系列物中，α-、β-和γ-歐柏側酚對hTYR的抑制能力分別約為104.93倍、99.78倍和16.43倍，且對hTYR的抑制弱於mTYR。通過比較hTYR和mTYR獲得的值以及這些酶活性位點的氨基酸組成來解釋歐柏側酚系列物的活性差異。

圖16 薴麻素（a，b和c）與hTYR（V377，I368，H367和S380）和mTYR（P257，V243，H242和A260）142的結合相互作用的示意圖

為了理解抑制機制，利用hTYR同源性模型預測了γ-歐柏側酚的結合模式。結果表明，γ-歐柏側酚螯合物的羰基和羥基在hTYR的活性位點上具有兩個銅離子。歐側柏酚的託酚酮支架與His367的咪唑環形成堆積作用，並與Val377的異丙基形成疏水作用。歐柏側酚的異丙基團與Ile368形成疏水相互作用。此外，對其他歐柏側酚系列物(α和β)的抑制作用的比較結果表明，α-歐柏側酚異丙基與Val377和S380的範德爾瓦斯(van der Waals，VdW)衝突可能降低對hTYR的抑制活性。在歐柏側酚系列物中的λ-歐柏側酚對hTYR有更高抑制活性的主要原因，被認為是異丙基與Ile368的疏水作用。相反，在mTYR中，Val377和Ser380分別被脯氨酸(P257)和丙氨酸(A260)取代，因此可以認為α-歐柏側酚的異丙基與A260和P257幾乎沒有VdW衝突(圖16)。這就解釋了為什麼α-歐柏側酚對mTYR(IC 50 = 9.53μM)的抑制作用比hTYR (IC 50>1000μM)強兩個數量級以上。因此，有人提出hTYR中mTYR和Ser380中Ala260的差異顯著影響了α-歐柏側酚的抑制特性。

Wang及其同事等人，近來發現天然產物linderanolide B（化合物55）和從樟屬的莖中分離出的subamolide A（化合物56）被證明在低劑量下，對蘑菇酪氨酸酶具有較好的體外抑制能力(圖15)。這兩種化合物均顯示出各種濃度的兩種化合物處理過的人角質形成細胞、黑素細胞和成纖維細胞的細胞活力。低劑量(0.01-1.0μM)的治療對人皮膚細胞沒有明顯的細胞毒性。該研究顯示，在48小時處理後，這兩種化合物能以1 μM的劑量來減少50%的人酪氨酸酶活性，並有效抑制(減少40%)HEMn-MP細胞中黑色素的形成。化合物55和56均顯示出對斑馬魚體內色素沉著具有顯著的抑制潛力，即使是在低劑量下也沒有觀察到有明顯細胞毒性。因此，這兩種化合物是有效的新型酪氨酸酶抑製劑，可作為皮膚增白劑。

圖15 酪氨酸酶抑製劑的化學結構：（a）thujaplicin analagoues（52-54），（b）linderanolide B和subamolide A和（c）對苯二酚衍生物。

在另一項研究中，Kolbe等人研究了曲酸、對苯二酚、熊果苷與其他眾所周知的化合物4-丁基間苯二酚（化合物57）對人酪氨酸酶的抑制作用，以及對黑種人（MelanoDerm TM）的皮膚模型培養物產生的抑制作用。1995年，引入間苯二酚衍生物的4-丁基間苯二酚對酪氨酸酶和TRP-1均具有抑制作用。結果表明，4-丁基間苯二酚被證明是一種高效的人體酪氨酸酶抑製劑，IC50值為21 μmol/L，當濃度高於在100 μmol/L時能完全抑制。4-丁基間苯二酚顯示出比曲酸更強的抑制活性（20倍），其顯示的IC50值為500 μmol/L，最大抑制（89%）的濃度為5.6 mmol/L。熊果苷和對苯二酚（氫醌）是較差的人體酪氨酸酶抑製劑，其IC 50值在毫摩爾的範圍內，即熊果苷為6500 μmol/L，對二苯酚為4400 μmol/L。然而，它們都沒有完全抑制人體酪氨酸酶的活性。

在黑種人皮膚模型中，熊果苷對黑色素生成的抑制效果不理想，其IC 50值為500 μmol/L，而曲酸的抑制濃度IC 50值為400 μmol/L。有趣的是，對苯二酚抑制黑色素的產生，其IC50值低於40 μmol/L，這可能與酪氨酸酶抑制的機制的不同有關。4-丁基間苯二酚是最有效的抑製劑，其IC 50值為13.5μmol/L。在臨牀研究中，證實了4-丁間苯二酚的體內抑制功效。前臂上有老年斑的患者每天塗抹配方兩次來治療兩塊老年斑，配方中含有4-正丁基間苯二酚（化合物57）、4-己基間苯二酚（化合物58）和4-苯乙基間苯二酚（化合物59）。在8周內，4-丁基間苯二酚（57）顯著減少了老年斑的出現，而4-己基間苯二酚、4-苯基乙基間苯二酚在12周後表現出顯著的效果。

在第二項研究中表明，4-丁基間苯二酚比4-己基間苯二酚和4-苯基乙基間苯二酚更有效。由此產生的色素沉著過度的臨牀試驗表明，4-丁基間苯二酚可能是一種有價值的活性化合物，可用於治療色素沉著的失調。事實上，4-丁基間苯二酚已被用於治療黃褐斑。在所有已發表的文獻中，含有0.1%濃度的4-丁基間苯二酚的乳膏在用於治療黃褐斑的過程中表現出快速的療效、安全性和耐受性。近期的研究報道，0.3%濃度的4-丁間苯二酚乳膏對於治療印度的白癜風患者是安全、有效，耐受性良好的。

總結

催化黑色素合成的限速步驟，酪氨酸酶已成為開發色素減退劑的最重要的目標之一。事實上，酪氨酸酶是被用來研究最多的抑制黑色素生成的靶標。因此，靶向酪氨酸酶的抑製劑可以特異性地抑制細胞中的黑色素的生成而沒有其他副作用。因此，近年來，已經開發了許多抑製劑，圖4概況了本綜述中討論的抑製劑。本綜述討論了不同類別的抑製劑，包括查爾酮，白藜蘆醇和黃烷酮。

非常有趣的是，本報告中新加了一個分類：具有β-苯基-α，β-不飽和羰基支架的抑製劑，此類抑製劑表現出了顯著的酪氨酸酶活性的抑制作用。特別是，亞苄基-2-硫代乙內醯脲和5-苯亞甲基（硫代）巴比妥酸鹽表現出更強的抑制能力（圖7）。

在這些支架上進行更多藥物化學的研究和構效關係分析後，相信在未來會開發出更多新的抑製劑。另一種新的支架：雙（4-羥基苄基）硫化物，即化合物36對酪氨酸酶表現出優異的抑制效力，其IC 50值為0.5 μM，K i值為58 nM。

在人體黑素細胞系統中，用濃度為50 μM的化合物36能有效減少20％的黑色素，且沒有顯著的細胞毒性。此外，斑馬魚體內試驗顯示，化合物36有效地減少了黑色素的形成而沒有副作用。

還有，在急性口服毒性研究中，也證實了化合物36在小鼠體內沒有可辨別的細胞毒性。因此，總體來說，化合物36是一種安全有效，可開發用於皮膚美白的藥理學試劑的潛在成分。

重新利用現有藥物，是目前開發強效黑色素生成抑製劑的藥物的重要方法之一。根據現有藥物相關的數據，將可減少開發新型藥物所需要的時間和成本。這種方法有幾個優點，包括：可用性，更低的成本和安全性/耐受性。

長期以來，苯基硫脲被公認為是一種酪氨酸酶抑製劑。研究人員在臨牀使用中，檢索了硫脲衍生物並研究了它們對酪氨酸酶活性的影響。其中，乙硫異煙胺（化合物26a）及其衍生物（化合物26c-26e），包括丙硫磷醯胺（化合物26b），都被鑒定為是有效的酪氨酸酶抑製劑（圖9）。乙硫異煙胺是一種需經批准的二線抗結核藥物，用於治療耐多葯結核病。許多抗甲狀腺藥物被確定為是有效的酪氨酸酶抑製劑，特別是甲巰咪唑（化合物27a），卡馬西唑（化合物27b），硫尿嘧啶（化合物27c），甲基硫氧嘧啶（化合物27d）和丙基硫氧嘧啶（化合物27e）能夠抑制蘑菇酪氨酸酶的活性（圖9）。

通常，蘑菇酪氨酸酶是最常用的體外模型，常用來開發皮膚增白物質和篩選色素減退劑，但在人和小鼠的黑素細胞裂解物的研究中使用的幾率較小。這是因為來自蘑菇雙孢蘑菇的酪氨酸酶是大量可用，且容易純化的。然而，在很多層面上，來自蘑菇的酪氨酸酶與人體的酪氨酸酶是非常不同的。以分泌形式存在的蘑菇酪氨酸酶，存在於細胞胞質溶膠中的四聚體酶，而人體的酪氨酸酶是單體和無活性的，是經過糖基化膜結合的形式而得的。

此外，據研究報道，人體的酪氨酸酶對L-多巴的氧化活性的親和力，比蘑菇酪氨酸酶高6倍，人體酪氨酸酶和蘑菇酪氨酸酶對L-多巴的K m值分別為0.31 mM和1.88 mM。

此外，人體酪氨酸酶和蘑菇酪氨酸酶之間的氨基酸序列的同一性為23％。這些結構上的差異與通過AbTYR和hTYR這兩種酪氨酸酶來測定酪氨酸酶的抑制活性有著密切的相關性。事實上，發現許多黑色素生成抑製劑對蘑菇酪氨酸酶的活性沒有表現出抑制的能力（參見歐柏側酚，人體酪氨酸酶抑製劑部分的比較）。

總之，我們希望這篇綜述對於研究黑色素生成的藥物化學家，尤其是酪氨酸酶蛋白，對於鑒定具有藥物特性的新型抑製劑會有很大幫助。

原文出處 | Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry

作者 | Thanigaimalai Pillaiyara

翻譯 | 菠蘿斯基&言雨瀟

審校 | 趙培均博士


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