撰文 | 伊凱

責編 | 兮

查爾斯·達爾文（Charles Darwin）在其1859年所發表的《物種起源

》（The Origin of Species）一書中提出的以自然選擇（natural selection）為核心的進化論（Theory of Evolution）誕生不久即被科學界廣泛接受為關於物種起源和演化的真確學說。相較於此，由德國動物學家威廉·魯（Wilhelm Roux）最早於1888年根據不同組織間細胞常常互相侵襲的觀察而提出的機體發育過程中遵循自然選擇規律的細胞競爭（cell competition）假說卻經歷了長達一個世紀的爭論，直到1975年Morata和Ripoll在Developmental Biology上發表了利用果蠅核糖體蛋白Minutes突變體驗證雜合子細胞處於競爭失利狀態的實驗證據才獲得了普遍認同【1】。

細胞競爭模型的核心是低競爭力的失敗者（loser）細胞被鄰近的勝利者（winner）細胞感知並清除，其具有三個主要特徵：1）失敗者細胞的增殖速率顯著更低；2）對失敗者細胞的清除決定於其與成功者細胞的接觸；3）失敗者細胞與成功者細胞的相對狀態隨著發育環境的改變而不斷變化。目前，已有多項證據表明細胞競爭同樣存在於哺乳動物發育過程中，並且可能是一種重要的抑癌機制【2-5】。然而，細胞競爭作為一種細胞群體選擇機制在機體發育中的潛在關鍵角色仍未得到詳盡闡釋。

2019年5月16日，來自美國洛克菲勒大學（RockefellerUniversity）的Elaine Fuchs實驗室在Nature上發表長文Distinct modes of cell competitionshape mammalian tissue morphogenesis，報道了小鼠皮膚髮育過程中的細胞競爭現象及其生理重要性。

在小鼠胚胎的形態發育過程中，其表皮（epidermis）面積會擴大近三十倍以適應機體的快速生長，且最初的單層結構也會分層和分化至出生時的多層屏障結構。

為了探究這一複雜過程中可能存在的細胞競爭，研究人員利用Cre-loxP基因重組技術構建了關鍵轉錄因子Mycn雜合子嵌合缺失的小鼠胚胎模型，即通過慢病毒轉染相同滴度的CreRFP或GFP載體使小鼠胚胎表皮中同時存在幾乎等量的野生型細胞和Mycn雜合缺失的細胞（下圖a）。Myc缺失已被證實在果蠅和小鼠細胞中能夠引起細胞競爭。通過顯微鏡熒光定量分析和基於5-乙炔基-2』脫氧尿嘧啶核苷（EdU）的細胞增殖速率測定，研究者發現Mycn雜合缺失的小鼠胚胎表皮細胞相對於野生型細胞的數量顯著下降（下圖bcd），增殖速度也更低（下圖e）。這一結果表明Mycn雜合缺失的細胞符合細胞競爭三大特徵的第一點，即失敗者細胞的競爭力顯著低於成功者細胞。

研究者接下來分析了該情景與細胞競爭的第二個特徵，即失敗者細胞被清除取決於與成功者細胞的直接接觸的符合程度。首先，研究人員利用Rosa26mT/mG（由斯坦福大學駱利群實驗室於2007開發的雙熒光報告小鼠品系，其中tdTotamo熒光蛋白基因位於兩個loxP位點之間，當Cre蛋白表達將其切除後即從紅色熒光轉換至EGFP釋放的綠色熒光【6】）小鼠構建了野生型和Mycn雜合缺失的小鼠胚胎模型（下圖f），從而可直接判斷成功者細胞與失敗者細胞的空間關係。通過定量分析，研究者發現Mycn雜合缺失的失敗者細胞僅在與野生型成功者細胞相鄰時發生顯著程度的死亡（下圖h）。經由蛋白免疫熒光分析，作者還發現失敗者細胞中出現了破碎的DNA片段和激活的細胞凋亡酶（下圖ijk），暗示了失敗者細胞的低競爭力可能與凋亡水平增加相關。

細胞競爭的第三個特徵是細胞成為失敗者還是成功者取決於鄰近細胞的狀態，即存在動態變化過程。具體到小鼠表皮細胞競爭的情形中，研究人員需要確定Mycn的雜合缺失並非是細胞成為失敗者的充要條件。因此，研究者構建了小鼠胚胎原始外胚層（primitive ectoderm）所有細胞均Mycn雜合缺失的模型，發現與野生型對照類似其中幾乎不存在細胞凋亡，而當進一步利用shRNA敲降Mycn後則觀察到Mycn完全丟失導致了失敗者細胞的出現，而Mycn雜合缺失的細胞仍然處於成功者細胞的狀態（下圖）。這一結果有力地證明了細胞競爭中的成功者與失敗者地位是相對變化的，其決定性因素並非細胞本身特徵，而是其鄰近細胞的競爭力狀態。

為了理解成功者細胞對失敗者細胞形成競爭優勢的具體分子機制，且考慮到前述細胞競爭與細胞凋亡的直接關聯，研究人員構建了Dox誘導的持續表達抑制細胞凋亡的BCL-XL蛋白的Mycn雜合子嵌合缺失小鼠模型。令人驚訝的是，對細胞凋亡的抑制完全消除了失敗者細胞的產生，且Mycn雜合缺失細胞不再表現出更低的增值速率（下圖）。這一結果表明，細胞凋亡通路的激活對於成功者細胞建立對失敗者細胞的優勢是必要的。

在理解了細胞競爭力分化所依賴的分子通路後，研究人員還試圖解釋失敗者細胞被清除的具體機制。考慮到成體中的表皮細胞已知具有吞噬死亡細胞的能力且胚胎表皮前體細胞亦表達多種胞吞複合體蛋白，研究者利用shRNA敲降了關鍵胞吞基因Gulp1的表達水平，發現由失敗者細胞凋亡產生細胞殘骸顯著增多。這一結果說明了胞吞機制是成功者細胞清除周圍失敗者細胞的主要途徑。

儘管前述實驗結果基本闡明了Mycn雜合缺失導致的細胞競爭的主要特徵及發生機制，但研究者仍不明確無外源干擾的小鼠胚胎表皮發育過程中是否存在內源性的細胞競爭。為探究這一問題，研究人員利用單細胞測序技術分析了正常小鼠胚胎表皮中膜聯蛋白V（Annexin V，細胞凋亡標誌物）陽性細胞（假定為失敗者細胞）及敲除模型小鼠中的Mycn雜合缺失細胞（已知為失敗者細胞）的融合基因表達譜和正常小鼠胚胎表皮中膜聯蛋白V陰性細胞（假定為成功者細胞）的基因表達譜的差異，發現多個在失敗者細胞中表達下調的基因均為核糖體基因（下圖a）。這也與已知核糖體基因功能抑制導致細胞喪失競爭力的事實相符。接著，研究人員利用差異表達基因定義了細胞成功分數和失敗分數，並對胚胎期12.5天和17.5天的表皮細胞進行了打分，發現17.5天時小鼠表皮具有顯著更低的失敗者細胞比例（下圖c），這符合失敗者細胞在發育過程中被逐步清除的預期。

依據上述觀察到的小鼠胚胎期12.5天與17.5天的表皮在失敗者細胞比例上的顯著差異，研究者希望進一步探究這是否意味著小鼠胚胎在成熟後即不再需要細胞競爭的存在。通過對小鼠胚胎髮育多個時間點的表皮中的細胞殘骸和胞吞複合體基因表達進行定量分析，研究者發現這一由細胞凋亡和胞吞決定的細胞競爭強度隨胚胎髮育而不斷降低（下圖ab）。但這並不能作為細胞競爭本身不再存在的證據，因為仍然存在細胞競爭轉換髮生機制的可能性。的確，考慮到胚胎期17.5天的小鼠表皮中的失敗者細胞顯著富集了具有已分化特徵的細胞，研究人員利用顯微鏡熒光定量分析該時間內的成功者與失敗者細胞的分化狀態，發現顯著更多的失敗者細胞富集在由K10和FLG標定的末端分化細胞群中（下圖c）。進一步地，研究者還發現，相較於成功者細胞以接近於平行基底膜的分裂角度（以紡錘絲衡量）進行增殖，失敗者細胞的分裂角度明顯增大，接近垂直基底膜（下圖d）。這意味著失敗者細胞此時的主要命運是進行分化並移動至外層分化細胞群中，而成功者細胞則保留在持續增殖的前體細胞層中。有趣的是，研究者還發現失敗者細胞分裂的角度與其相鄰的成功者細胞的數量顯著正相關，這符合細胞競爭中競爭力差異程度是命運分化的決定因素的結論。總之，上述一系列實驗證實了小鼠胚胎髮育過程中的表皮細胞競爭存在著第二種主要機制，即由成功者細胞驅動的失敗者細胞分化和外遷。

最後，研究人員還分析了細胞競爭在小鼠胚胎表皮形態發育過程中的生理意義。屏障是小鼠表皮的主要功能，因此研究者探究了經由BCL-XL高表達抑制基於細胞凋亡的細胞競爭對錶皮屏障功能的影響，結果發現作為屏障重要組分的緊密連接（tight junction）的核心蛋白Claudin-1和ZO-1均在缺乏細胞競爭的表皮中顯著丟失（下圖ab）。類似地，研究者通過表皮水分丟失實驗（?trans-epidermal water loss，TEWL）也驗證了細胞競爭缺乏對屏障功能的削弱（下圖c）。值得注意的是，上述屏障功能減弱的現象在出生後的小鼠中不再存在，表明即使基於細胞凋亡的胚胎髮育早期的細胞競爭被抑制，機體仍能通過第二種機制即分化並驅離失敗者來保證屏障功能的正常。

總之，這項研究憑藉巧妙的實驗設計和嚴謹的邏輯推導清晰闡釋了細胞競爭這一重要事件在機體形態發育過程中的複雜機制和生理重要性，其提出的細胞競爭從依賴失敗者凋亡轉變到以失敗者分化和外遷為主的雙重機制模型不同於以往的任何細胞競爭模型，尤其具有獨特性和新穎性。

原文鏈接：

doi.org/10.1038/s41586-

製版人：小嫻子

參考文獻

1. Morata, G. & Ripoll, P. Minutes: Mutants of Drosophila autonomouslyaffecting cell division rate. Dev. Biol. (1975).doi:10.1016/0012-1606(75)90330-9

2. Clavería, C., Giovinazzo, G., Sierra, R. & Torres, M. Myc-drivenendogenous cell competition in the early mammalian embryo. Nature(2013). doi:10.1038/nature12389

3. Meyer, S. N. et al. An ancient defense system eliminates unfitcells from developing tissues during cell competition. Science (80-. ).(2014). doi:10.1126/science.1258236

4. Li, W. & Baker, N. E. Engulfment Is Required for Cell Competition. Cell(2007). doi:10.1016/j.cell.2007.03.054

5. Vincent, J. P., Fletcher, A. G. & Baena-Lopez, L. A. Mechanisms andmechanics of cell competition in epithelia. Nature Reviews Molecular CellBiology (2013). doi:10.1038/nrm3639

6. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, N. & Luo, L. A globaldouble-fluorescent cre reporter mouse. Genesis (2007).doi:10.1002/dvg.20335

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