雖然CTCF-粘連蛋白的環擠出對於哺乳動物細胞中TAD的形成是至關重要的，但仍有相當數量的結構域邊界不受CTCF敲除的影響。此外，在轉錄因子誘導的B淋巴細胞重編程的跨時間點研究中以及在神經分化的不連續階段中，CTCF的結合動態模式無法解釋TAD邊界的動態變化，這表明存在其他未知的調節因子。由於幾種轉錄因子如Krüppel樣因子4（KLF4）和八聚體結合轉錄因子4（OCT4）已被證明與粘連蛋白存在相互作用，因此研究者推測它們也可通過染色質環擠出模型調節基因組構象。這一概念得到以下觀察結果的支持：轉錄因子Zelda對於在果蠅胚胎髮生過程中建立特定TAD邊界具有重要作用。不同於染色質環擠出模型，對活性或非活性染色質具有親和力的多價轉錄因子複合物可通過在不同基因組位點之間產生連接橋來形成拓撲結構域。這種自組織機制類似於轉錄因子——共激活因子互作誘導的凝聚體形成，表明相分離和區室化也可能在TAD形成中發揮作用。

值得注意的是，TAD本身並不具有同質化的準確定義。不同TAD之間的尺度差異很大，且往往表現為相互嵌套的層級結構（因而有時又被稱做sub-TAD）。許多TAD由染色質環形成，並在高解析度Hi-C圖中顯示為其頂點處的特徵點狀相互作用信號。然而，在這些由染色質環構成的結構域之外，亦存在非環狀結構TAD（即缺乏點狀Hi-C信號），它們往往與A、B區室結構域類似。後者近來被稱為區室化結構域（compartmental domain）。因此，這兩類TAD似乎是由不同的機制形成的，但目前尚不清楚它們在功能上是否也存在差異。

局部互作連接基因調控元件

啟動子與增強子間的相互作用多數情況下發生在單個TAD之內，表明TAD限制了基因調控元件在核內的搜索空間（search space）。的確，當TAD邊界遭受破壞或重建時，可促進新的啟動子——增強子相互作用的形成，從而改變基因表達。TAD是基因調控的拓撲單元的觀點進一步得到了以下觀點的支持：TAD通常具有同質的染色質特徵並表現出協同的轉錄反應。值得注意的是，TAD的形成過程，例如通過粘連蛋白驅動的染色質環擠出，亦可促進位於TAD邊界附近的啟動子和增強子之間的相互作用。

除了普遍存在的染色質相關蛋白如粘連蛋白和中介體外，一些譜系限制性（lineage-restricted）轉錄因子，包括LDB1、PAX5、KLF4和NANOG等，都可介導增強子——啟動子互作。另外，經由蛋白質工程手段寡聚化的LDB1或YY1被證明可以驅動特定的啟動子——增強子相互作用，這為轉錄因子在該過程中的豐富角色提供了令人信服的證據。與前述內容類似，由轉錄因子或其共激活因子誘導的相分離也為在TAD內形成精細染色質相互作用結構提供了合理的機制。在該類情形下，與傳統的特定啟動子——增強子相互作用的穩定鎖鑰模型（lock-and-key model）不同，轉錄因子通過局部聚集體的形成誘導基因調控位點之間的動態接觸。

轉錄過程本身也可能影響核內空間中啟動子和增強子的接近程度。除了RNAPII相關蛋白可能通過相分離在啟動子——增強子區室化中起到重要作用，RNAPII本身聚集形成的動態複合體亦被認為可通過招募特定基因座來形成啟動子——增強子互作環。此外，研究者發現轉錄激活程度與基因調控元件的機動性（mobility）相關，暗示了轉錄起始和啟動子——增強子相互作用之間存在正反饋機制。

基因組三維構象與細胞命運決定

上述染色質在核內的非隨機空間組織過程暗示了基因組三維構象在轉錄因子驅動的基因調控中的作用，並由此決定細胞命運。在本節中，我們討論目前對基因組形態——功能關係的理解，並指出基因組三維構象可以通過促進或削弱轉錄因子功能來控制轉錄可塑性。

基因組三維構象的特異性與異質性

基因組構象在一定程度上是細胞特異性的。例如，染色體區域的空間位置在不同細胞類型之間有所變化。此外，胚胎幹細胞分化過程中，基因與核纖層之間的聯繫也會發生變化（13-27％的核纖層相關結構域是動態變化的），而在細胞分化或重編程期間，A—B區室之間基因組交換的比例高達約35％。雖然TAD一開始被認為在不同細胞類型中具有不變的特性，但越來越多的證據表明，大約10-40％的TAD邊界是細胞類型特異性的，且TAD邊界的隔絕程度也是可塑的。不過，基因組構象中的具有最強動態變化特徵的還數啟動子——增強子相互作用，一些特定相互作用的發生概率表現出顯著程度的細胞類型特異性。

當對單個細胞中的全基因組摺疊特徵進行分析時，基因組構象也表現出顯著的細胞類型特異性。單細胞分析的結果符合染色體區室化、TAD和染色質環是存在於單細胞中的結構實體的觀點，儘管它們都具有不同程度的細胞間變異。單細胞中的A—B區室狀態似乎相當穩定，並且與對應的大體細胞測序得出的轉錄活性高度相關，與之相反，單細胞中TAD卻是可變程度相當高的。這些結果表明，在細胞集群的不同個體間，一個特定基因往往僅與A或B區室相關聯，相反，同一基因可以在尺度和聚集性不同的TAD之間變動，這亦符合在單分子成像研究中觀察到的CTCF-粘連蛋白環的連續性形成和消解。值得注意的是，對粘連蛋白進行敲除不會消除單細胞中的TAD邊界的形成，但卻對TAD邊界定位相當重要，這似乎解釋了在粘連蛋白敲除的細胞群中由Hi-C圖觀察到的不同TAD邊界的丟失。

基因組構象對轉錄調控的影響

近期關於在細胞分化或重編程過程中整合基因組三維摺疊和基因表達動態變化的研究進一步展示了轉錄調控中基因組構象變化所發揮的重要作用。例如，由轉錄因子驅動的B淋巴細胞重編程為多層幹細胞的的時程研究報道了染色質狀態、基因組構象和基因表達之間的密切聯繫。因此，當細胞在不同狀態之間遷移時，其基因組的空間組織的總體變化與局部轉錄和染色質狀態密切耦合，控制這些區域中的基因是被激活還是被抑制（下圖）。

那麼基因組構象的特徵具體如何影響基因轉錄呢？大量證據表明物理性接近（physical proximity）是增強子與啟動子遠距離互作的主要機制。例如，一項以定量顯微鏡為分析工具的實驗表明，單個果蠅細胞中轉基因的激活需要啟動子——增強子持續處於鄰近狀態，另一項研究發現在哺乳動物細胞中的引導啟動子——增強子產生相互作用能夠激活基因表達。在核內相對隔絕的染色質區域（例如TAD和染色質環）的相互作用域被認為是通過限制增強子的核內搜索域及相關轉錄因子從而促進特異性啟動子——增強子配對來發揮特定的基因調節功能。一項支持TAD在基因調控中的重要性的證據來自於將啟動子報告載體隨機整合至小鼠基因組中的實驗，研究者發現當這種整合發生在同一TAD內時會產生對應的組織特異性表達模式。另外，活細胞中的單分子轉錄因子成像實驗表明拓撲結構限制了細胞核中的轉錄因子運動動力學。正如這些研究所預測的，TAD邊界或染色質環錨定物的刪除（例如CTCF位點的缺失或倒置）經常導致鄰近基因的表達改變。此外，染色體重排可破壞TAD邊界，導致異常的的啟動子——增強子連接，造成發育缺陷或腫瘤發生。例如，在WNT6-IHH-EPHA4-PAX3基因座處破壞TAD邊界導致EPHA4基因的肢體發育特異性增強子介導的WNT6，IHH或PAX3異位激活（ectopicactivation），以及伴隨的EPHA4本身的表達缺失。這一對基因組構象和基因表達的干擾會導致人類手指或腳趾發育畸形。TAD邊界破壞也與重複序列擴增疾病（?repeat expansion disorder）相關，例如脆性X染色體綜合征（?fragile Xsyndrome）。

如上所述，從染色質中刪除CTCF或粘連蛋白會導致TAD結構的整體性破壞。但令人驚訝的是，拓撲隔離的顯著喪失並未伴隨廣泛的轉錄失調（少於1,000個基因受到影響且表達水平的變化很小），暗示了拓撲結構域在調控增強子活性方面的作用較為有限。這表明，TAD邊界要麼主要對細胞的轉錄組進行微調控，要麼僅對一部分基因的轉錄調控發揮重要作用。支持後一種觀點的一項證據是粘連蛋白的快速降解對與大尺度增強子聚集體（超級增強子，super enhancer）相關的基因的調節影響最甚，這可能是由於超級增強子區室化後造成了與其靶基因的分離。另外一項研究證明，由CTCF-粘連蛋白敲除引起的增強子和啟動子之間的新接觸的形成僅在細胞表達能夠募集必需轉錄共調節因子的相關轉錄因子時才造成基因表達改變。不過，這些研究給出的信息是有限的，因為他們只探究了CTCF-粘連蛋白敲除對穩態基因表達的短期影響。正是因此，最近關於粘連蛋白敲除影響巨噬細胞對內毒素的響應基因表達的發現便顯得十分有趣，這表明TAD和染色質環相比起維持細胞基因轉錄狀態而言對建立細胞轉錄調控網路更重要。

基因組構象的更高級三維結構，例如A-B區室化，與調節基因表達的功能相關性仍不太清楚，主要是由於在這些水平上人為操縱基因組三維摺疊仍然是相當困難的。不過，已經有研究指出，將具有相似生化活性的區域聚集在特定核標誌物周圍或將它們分離至各染色體區室，可以通過增加相關因子的局部濃度來提高基因調控過程的效率。對核內空間中特定基因的位置在個體細胞之間顯著變動（意味著基因在每個細胞中具有不同的長程相鄰模式）的觀察被用來說明核內的區室化和放射狀基因定位過於隨機而基本上不太可能影響轉錄調控。然而，在單細胞中觀察到的可能由轉錄因子介導的凝聚物形成所驅動的基因的穩定A-B區室化，表明染色體區室化在轉錄調控中的角色可能比人們之前所預期的更重要。

形式（基因組構象）與功能（基因轉錄調控）的聯繫

該領域內存在一個圍繞著基因組構象，染色質修飾和轉錄之間的因果關係的核心爭論。僅僅依靠特定拓撲結構的存在並不足以啟動基因調控過程。例如，將基因座連接到核纖層不一定能導致基因表達抑制，並且啟動子——增強子相互作用的發生也不一定導致後續基因激活。另一方面，轉錄過程對基因組構象具有可探測程度的影響，轉錄活性也被用做計算機模擬中基因組三維摺疊的參數。然而，以實驗手段對基因組三維構象的操縱揭示了誘導啟動子——增強子接近或破壞TAD邊界可導致基因表達改變。相反，抑制轉錄卻不會破壞現有的基因組構象，也不會阻止早期胚胎髮育過程中基因組構象的建立或維持。此外，最近的一項研究表明PAX5轉錄因子即使在獨立於轉錄的情況下也能夠修飾基因組拓撲結構。最後，在將體細胞轉化為多能幹細胞的過程中，染色體區室化和TAD邊界的變化通常先於基因表達變化，這就解釋了關鍵多能性基因Oct4，Nanog和Sox2的在激活特徵上的差異。因而，在細胞命運轉換期間，功能（轉錄）似乎常常與形式（基因組構象）相符。

那麼染色質修飾又起到什麼樣的作用呢？對B細胞重編程過程的多時間點分析揭示了轉錄因子驅動的染色質狀態變化（由H3K4me2修飾表徵）與染色體區室化變化同時進行或在其之前發生，而反向過程卻幾乎不存在。此外，染色質壓縮組裝和組蛋白的翻譯後修飾足以改變基因定位或誘導A-B區室轉換。這意味著轉錄因子介導的表觀基因組修飾至少在區室化水平上可以驅動基因組構象變化。由轉錄因子和RNAPII調節的染色質狀態的動態變化也被認為在調控TAD或TAD內部相互作用中具有積極作用，考慮到轉錄因子和共激活因子具有促進局部凝聚物形成的能力，這確是一種合理的機制。

總之，儘管基因轉錄、染色質狀態和基因組構象之間存在連續的相互作用（下圖），但基因組的空間組織並不一定以轉錄為必需。同時，由轉錄因子誘導的基因組構象改變可以為隨後的轉錄變化創造一個可依賴的基礎。因此，這些觀察結果表明，基因組三維摺疊在細胞命運決定中對於形塑基因表達程序具有重要作用。

轉錄因子與基因組構象互作

正如在本綜述開始時所討論的，細胞身份被認為是由轉錄因子，其他染色質相關蛋白和染色質空間構象之間的動態相互作用共同決定的。轉錄因子非常適合賦予染色質時空維度上的改變，因為它們具有細胞類型特異性表達特徵，對信號的反應性以及DNA序列特異性和開拓難以接近的染色質的能力。不過，基因組構象可以抑制或促進與其靶標相關的轉錄因子的活躍程度，從而弱化或加強轉錄可塑性。在此，我們設想了四個功能上截然不同的角色，通過這些角色，基因組構象本身及其與轉錄因子的相互作用可以控制細胞命運：「屏障物」（barrier），「引導物」（primer），「優化者」（optimizer）和「促進者」（facilitator）（下圖a、b、c、d）。雖然這些角色的劃分可以幫助舉例說明基因組三維組織如何影響基因調控過程，但下面闡述的機制通常則包含互有重疊和共同協調的方式。

基因組構象可以作為由激活轉錄因子的信號誘導的表型變化的「屏障物」，有效地對抗擾動而穩定細胞的狀態。例如，通過通過能夠檢測多向染色質構象的技術可視化的被協同轉錄因子調控的基因群的共定位被認為可保護多能幹細胞狀態（下圖a），比如NANOG可以直接誘導靶基因的空間聚類，形成一個調節中樞（regulatory hub）。又如，多梳蛋白複合物可以形成含有被抑制基因群的調節中樞。因此，由相同調節因子控制的基因群的空間接近性被認為增強了維持其活性或非活性狀態的穩健性。從機制上講，調節蛋白可以通過同型二聚化或通過低複雜性結構域之間的相互作用形成這種空間中樞。這反過來會引起（瞬時）相分離並驅動受調節基因的區室化。或者，基因組構象可以直接阻止誘導的細胞命運變化，例如拓撲結構域限制了與其靶標調控元件結合的轉錄因子的活性。此外，由於常染色質——異染色質（或A-B區室）相分離邊界似乎是蛋白質擴散的屏障，染色質區室化可能會阻止激活的轉錄因子複合物進入液狀B區室。這種情形解釋了在B淋巴細胞重編程期間多能性基因Oct4幾乎是瞬間被Yamanaka轉錄因子所激活，而Sox2則不是，因為Oct4已經存在於轉錄因子可接近的A區室中，而Sox2卻是處於B區室中的（下圖a）。

染色質構象也可以作為「引導物」，為轉錄因子提供破壞細胞穩定狀態的機會（下圖b）。預先形成的啟動子——增強子相互作用可以產生一種預備的調節環境，使非活躍基因在接受特定的刺激後能進行快速激活。通過在A隔室中定位非活躍基因也可以產生類似的啟動效果（例如下圖a中的Oct4）。此外，基因調控複合體可以利用基因組構象來更有效地維持基因在發育過程中的預備激活狀態。例如，多梳蛋白在多能細胞中介導形成的三維調節中樞增強了對分化相關基因的抑制，但同時也確保它們處於一個預備狀態，從而能在遭遇分化信號時完成快速去抑制（下圖b）。更一般地，多能幹細胞中的基因組三維構象表現出獨特的特性，可以解釋它們非同一般的發育可塑性。依據這些原則，由高丰度的染色質相關高遷移家族蛋白B2（HMGB2）蛋白介導的拓撲重組被認為可用於預備細胞以激活後續衰老程序。

基因組拓撲結構還可以在轉錄因子誘導的細胞狀態轉換期間充當基因表達的局部「優化者」（下圖c）。例如，細胞在重編程期間必須準確建立啟動子和細胞多能性相關基因增強子之間的接觸以確保正確的轉錄輸出。在B淋巴細胞發育過程中，特定轉錄因子與免疫球蛋白基因增強子的結合確保了單個V、D、或 J片段具有相同的重組機會，從而最大化抗原受體多樣性。這是通過基因座收縮（locus contraction）實現的，使得V段能夠移動到靠近重組中心的位置，即使其位於超過一百萬個鹼基之外（下圖c）。基因座收縮的功能受損並不能阻止重組發生和淋巴細胞成熟，相反，它會導致線性基因組中顯著富集近端V段的重組。值得說明的是，在免疫球蛋白輕鏈基因座重組之前，轉錄因子在重組中心內結合增強子，並通過與兆鹼基尺度的V基因區域的幾乎隨機的相互作用引發基因座收縮。在被稱為增強子聚焦（enhancer focusing）的過程中，分化信號激活額外的轉錄因子以依次地優化上述相互作用並建立高度協調的增強子相互作用組，以校準V區段重組頻率（下圖c）。

最後，拓撲重組本身還可以充當「促進者」，在不依賴於特定信號響應調節因子的激活的情況下促進轉錄可塑性。例如，將LDB1的自締合（self-associating）結構域與β-球蛋白（β-globin）基因的啟動子相連，足以誘導β-球蛋白增強子與LDB1複合物的相互作用，激活基因表達（下圖d）。這為染色質環化促進細胞命運轉換的概念提供了原理驗證。由於基因組構象是高度動態的且在一定程度上是隨機性的，因此某些啟動子——增強子相互作用的隨機發生可能允許現有的轉錄因子複合物僅在一部分細胞中改變基因表達。因此基因組構象的自發變動可能通過為已存在的轉錄因子調控網路創造新的機會來塑造基因表達程序，從而誘導細胞命運的變化，包括與疾病相關的轉錄變化。這樣的機制已經在造血幹細胞中得到了實驗描述，其中染色體3上發生了將GATA2的增強子整合到含有EVI1致癌基因的TAD中的拓撲重組（下圖d）。這種新創建的基因組配置誘導EVI1過表達和GATA2水平降低，導致細胞轉化和癌症發生。

總之，細胞狀態特異性的基因組三維構象變化可能為調節因子發揮功能形成阻礙或創造機會，以保護或破壞細胞轉錄組的穩定性。在特定基因組構象的背景下，轉錄因子與輔因子和表觀基因組的交替相互作用並催化自組織過程（例如，相分離中聚合物的形成）以形成新的基因表達程序和細胞身份。基因組拓撲結構和基因表達的這種相對緩慢但逐漸進展的變化與最近從小鼠和人類造血細胞的單細胞基因表達分析獲得的證據一致。這些工作表明，多能祖細胞是通過連續的中間細胞狀態而非激進的二元切換來分化成不同的譜系。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1182-7

製版人：小嫻子

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