百奧賽圖/原創

20世紀90年代末，治療藥物主要由小分子化葯主導。而在近幾十年里，人類生命健康領域基於抗體藥物療法的使用呈現了指數級增長，並成為了治療藥物的一大組成部分。抗體已被證明在治療包括癌症、自身免疫、傳染病甚至神經退行性疾病在內的多種疾病方面具有廣泛的用途[1]。FDA僅在2018年就批准了59款新葯，創造了歷史新高（圖1）[2]。截止到目前，已有超過550種有希望的候選抗體處於不同的臨床試驗階段。它們目前佔全球100強藥品銷量的20%，而2007年這一比例僅為1%。[1,2]

圖1. 自1993年FDA批准的創新藥物[2]

抗體治療藥物的發展如此氣勢磅礴，小編在這裡得給大家提兩位大師，美國的生物學家Gerald Edelman 和英國的生物化學家Rodney Porter，因他們研究發現了抗體片段的原子解析度結構，在1972年被授予了諾貝爾獎（圖2）隨後GeorgesJ. F. Kohler和Cesar Milstein兩位科學家以此為基奠，利用雜交瘤技術獲得了單克隆抗體（mAb），進而開啟了現代抗體的工程時代。

Gerald Maurice Edelman Rodney Porter

圖2. 1972年諾貝爾獎獲得者[3,4]

單克隆抗體製備經典流程

單克隆抗體的產生得益於雜交瘤技術的發展，那麼單克隆抗體是如何製備的呢？下面小編給大家簡單概括一下，如圖3所示：

①將抗原注射到小鼠體內，幾周後取出脾臟並提取脾細胞；

②，③，④將小鼠的脾細胞與骨髓細胞融合以產生雜交瘤細胞，每個雜交瘤細胞無限地產生相同的抗體，然後使用抗原/抗體測定法篩選雜交瘤細胞，鎖定那些能產生預期抗體的細胞；

⑤細胞也可以冷凍並保存以備後用。這種製備流程很好用，可以比較容易地產生大量相同的特異性抗體；

⑥將產生優選抗體的雜交瘤細胞再集合重新篩選多次，直至分離出純系；

⑦，⑧這些細胞還可以在培養物中生長或注射到小鼠體內以誘導腫瘤。

圖3. 雜交瘤法生產單克隆抗體流程圖[5]

雖然上述方法已證明是穩健的並且仍廣泛用於產生單克隆抗體，但在臨床應用上卻出現了一定限制。

圖片來源：soogif

別急，別急，小編來告訴你。

因為早期使用的B淋巴細胞和骨髓瘤細胞來自小鼠，所產生的抗體來自小鼠的基因組（稱為「鼠抗體」），它們在人體中具有免疫原性，人體免疫系統會將鼠的mAb識別為外來抗原併產生免疫應答（稱為HAMA效應）。

進入人體內的小鼠單克隆抗體很快就會從循環中排出，在某些情況下也會發生過敏反應。此外，小鼠mAb的恆定區（部分免疫細胞識別部分）不能正常與負責抗體作用的人類細胞上的受體相互作用。因此，小鼠單克隆抗體很少產生對人體所需的治療效果，並且可能不安全。此後，科學家們紛紛開始向著mAb具備「人性化」的方向而努力。有一個很簡單的解決方案就是使用人的B淋巴細胞代替小鼠的B淋巴細胞，但這並不奏效，因為一方面，來自人細胞的雜交瘤是不穩定的，人B細胞不會產生針對人體組織的抗體；另一方面，用一些抗原來免疫人類會帶來安全與倫理道德問題。[6]

人鼠嵌合，人源化與全人單克隆抗體的開發

為了得到能夠應用於臨床上的mAb，科學家們堅持不懈的開發抗體。到目前為止，已開發出三個關鍵類型的抗體（圖4）：人鼠嵌合抗體（小鼠的可變區+人的恆定區），人源化抗體（小鼠CDR區+人的Igscaffold）和全人單克隆抗體（全人氨基酸）。[7]

圖4. 單克隆抗體結構與類型[7]

  • Rituximab是嵌合mAb，其在臨床上用於治療非霍奇金淋巴瘤。不幸的是，小鼠可變區在許多情況下仍然被認為是外來的，這使得嵌合mAb的應用得到了一定的限制。[6-7]
  • Alemtuzumab是人源化單克隆抗體，一種白血病抗癌新葯。人源化單克隆抗體在可變區域內，人類序列與小鼠序列之間存在進一步的交換，從而進一步降低免疫原性。但人源化單克隆抗體中存在鼠單克隆抗體殘留的CDR ，這些抗體通常失去了它們的結合活性。理想的情況是在可變區域中減少鼠源殘基，用以產生功能性而非免疫原性的人源化單克隆抗體。[6-7]
  • 全人抗體的出現：為了消除上述所有種類單克隆抗體的免疫原性問題，偉大的科學家們開始對小鼠B淋巴細胞進行改造，其抗體的所有部分改造成完全的人類基因。當這些小鼠被免疫時，它們的免疫反應將完全由人類抗體組成。再配合使用標準的雜交瘤技術從這些小鼠的B淋巴細胞中獲得完全的人單克隆抗體。[6-7]哇哦！這種「四兩撥千斤」的做法簡直是「鬼斧神工」了，有木有？

可替代雜交瘤技術的抗體篩選方法

說了這麼多，小編想問問小夥伴們，除了上面介紹的利用雜交瘤技術獲得抗體外，還有其他方法嗎？

圖片來源：網路

· 噬菌體抗體庫展示技術-scFv單鏈抗體的篩選

噬菌體展示是一種替代雜交瘤的篩選方法，與雜交瘤相似，起點是免疫動物的B淋巴細胞。主要篩選流程：

1. 提取B-淋巴細胞RNA，反轉錄成cDNA首先提取，使用與抗體基因保守的引物，通過PCR的方法擴增抗體基因，構建文庫；

2. 利用基因工程將編碼多肽或蛋白文庫的DNA序列插入到噬菌體的外殼蛋白基因，多肽或蛋白就可以在噬菌體的表面上表達出來；

3. 噬菌體再轉化到宿主細胞內，成熟後，從宿主中釋放出來；

4. 用固定有靶蛋白的培養板捕捉能特異結合靶蛋白的噬菌體；

5. 洗去未與靶點結合的噬菌體；

6. 將與靶點結合的噬菌體洗被脫下來，再感染宿主細胞，繁殖擴增，進行下一輪淘選；經抗體片段在大腸桿菌中的可溶性表達與免疫分析（包括ELISA或流式細胞術）就可以得到想要的高親和性抗體。[8,10]

圖5. 噬菌體抗體庫進行scFv抗體篩選流程圖[8]

那麼，這麼做有什麼好處呢？

首先，並不是所有文庫中表達的蛋白質表位都是有用的，這樣可以篩選感興趣的表位，以保證候選藥物的活性最佳；

其次，在體外實驗中，可以篩選人源與非人源靶點，這就節省了臨床前試驗的時間。

當然，體外篩選方法還有cDNA展示技術進行單域抗體(VHH)的體外篩選，核糖體展示技術篩選高親和力抗體scFv片段，外周血抗原特異性B淋巴細胞的測序及親和力測定等[1]，小編就不在這裡詳細贅述了。

· 迅捷可靠的藥物篩選途徑 （藥效篩選）

經過上述體外篩選後，我們可以拿到一系列具有結合活性的抗體克隆，那麼這些抗體克隆哪個才是最好的呢？

此時，我們需要在體外對這些抗體進一步做親和力分析，各種體外活性測試（ADCC，CDC等）和理化性質分析，選擇出一款具備良好作用效果的抗體。

當然，還有一種行之有效的辦法可以替代這些體外活性測試，那就直接利用建立腫瘤模型的免疫檢查點人源化小鼠在最初階段對抗體進行篩選，獲得體內藥效最好的分子！如圖6所示，將CMC階段G抗體進行不同劑量的體內藥效測試（靶點小鼠+MC38腸癌細胞系），依然具有較好的治療應答。如此，便能通過體內藥效拿到一款優秀的人源抗體候選藥物，溜得飛起有木有？！

圖6. CMC階段抗體體內驗證（數據來源：百奧賽圖）

好了，今天小編就為大家科普到這。百奧賽圖抗體藥物研發服務平台，擁有高效的免疫方法，完整的先導抗體篩選過程，可利用各種靶點人源化小鼠對抗體進行體內藥效篩選；平台還可對抗體進行工程化改造，體外活性測試以及理化性質分析等。如您有任何疑問，歡迎在下方留言，小編會及時回復噠~

參考文獻

[1]Roland Kontermann ,Stefan Dübel. Antibody Engineering. Methods andProtocols

Third Edition.2018.

[2]Asher Mullard.2018 FDA drug approvals. Nature Reviews Drug Discovery 18, 85–89

[3]baike.baidu.com/item/傑拉爾德·埃德爾曼/9559195?fr=aladdin

[4]de.wikipedia.org/wiki/R

[5]cellbiology.med.unsw.edu.au

[6]cellbiology.med.unsw.edu.au

[7]Hansel,Trevor T.etal.The safety and sideeffects of monoclonal antibodies. NatureReviews Drug Discovery 2010, 9 (4), 325-38 DOI: 10.1038/nrd3003.

[8]Frenzel A, Schirrmann T, Hust M Phage display-derived human antibodies in clinical developpment and therapy. MAbs. 2016 Oct;8(7):1177-1194. Epub 2016 Jul14.

[9]soogif.com/materialPage

[10]wenku.baidu.com/view/da

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