撰文丨tac.G

责编丨迦溆

自陈志坚教授发现cGAS-STING通路以来【1 ,2】，关于该通路的新研究一直如火如荼地进行著。仅仅在本月已有两篇Nature【3 ,4】（详见：Nature深度|细菌中也有cGAS？哈佛科学家发现发现一大类cGAS/DncV样核苷酸转移酶），两篇Cell主刊系列研究见刊（详见：Cell丨张学敏/李涛团队发现「百年老药」阿司匹林参与干扰素通路的调控功能与机制）。

cGAS-STING Pathway

cGAS（cyclic GMP–AMP synthase）作为胞质内环状GMP-AMP合成酶被发现，其可识别结合胞质内DNA发生活化，将胞质内AMP与GMP环化产生2』,3』-cGAMP。cGAMP 作为第二信号继续激活STING（stimulator of interferon genes），继而通过IRF3和TBK1促进干扰素IFN表达发挥抗病毒作用。

在常规情况下，细胞胞质内仅存在微量的DNA，故以cGAS为主的胞质DNA感受器处于未活化状态。当细胞处于某些应激状态，如DNA病毒感染，使胞质内DNA含量上升，即可通过cGAS-STING通路发挥抗病毒作用。陈志坚教授实验室发现，当胞质DNA达到阈值时，cGAS可与DNA结合并形成液滴（droplet），发生相分离现象【5】。此外，cGAS也并非安分地守在胞质内，其可在DNA损伤时入核发挥一定促癌作用【6】。（详见：戈宝学/毛志勇合作组揭示cGAS对DNA修复与肿瘤调控的新作用——专家点评）

在最近的Cell杂志上，来自哈佛医学院的Jonathan C. Kagan团队发表了题为Phosphoinositide Interactions Position cGAS at the Plasma Membrane to Ensure Efficient Distinction between Self- and Viral DNA的研究，首次指出cGAS并非既往理解的胞质蛋白，而是通过其N端结构域与质膜脂质结合的膜定位蛋白。在静息状态下，cGAS定位于胞膜，避免其识别胞质内微量DNA发生活化。而当cGAS突变异常定位于胞质后可对遗传毒性（genotoxic）发生过度活化。

病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）是固有免疫研究中的重要内容。cGAS一直作为细胞质中DNA的PAMPs进行研究。然而既往研究中对cGAS在细胞中的定位并没有「实锤」性的结论，通过其在胞质中与DNA结合活化推测为胞质蛋白。本文在研究之初即对这一观点提出质疑。

在进行THP-1细胞（人急性单核细胞白血病细胞）组分分离时，研究人员在组分分离的缓冲液内添加核酸酶（nuclease benzonase）以去除蛋白裂解液中DNA，避免其与cGAS形成液滴。该实验发现内源的cGAS主要存在于膜P100组分中，少量存在于核P25组分，并未在胞质S100组分中检测到cGAS，提示cGAS并非胞质蛋白。在鼠源和人源巨噬细胞中共聚焦扫描可见内源cGAS与F-Actin可共定位于胞膜。因既往研究均发现在DNA转染后可与cGAS在胞质中形成spot，本文研究人员也证实这一效应：当DNA转染30min后，cGAS不再聚集于细胞表面，而在胞质内内形成不同的点状聚集。

既往体外对cGAS结构域的研究发现C端结构域（160-522aa）具有识别DNA和合成cGAMP的功能，其N端结构域（1-159aa）具体的功能未知，但其也参与DNA结合和DNA诱导的液滴形成。研究人员利用截短体试验发现cGAS-N同样定位于胞膜，而cGAS-ΔN呈现胞质和胞核的定位，并在多个细胞系内得到相同验证。在对十种脊椎动物cGAS序列分析后发现，尽管其N端结构域序列不具有很高的保守性，但呈现较高的极性，其等电点比C端催化结构域高2个pH单位左右。

因N端结构域具有较强的极性，故其在胞质pH环境中可带正电。既往有生物物理学证据表明，质膜中磷酸磷脂醯肌醇PIPs （phosphoinositide phosphate）呈现负电，可以与带正电的PIPs结构结构域通过静电效应发生互作引起蛋白定位于胞膜【7】。研究人员证实cGAS可以与PIPs有互作，而与非磷酸化的磷脂醯肌醇和其他脂质成分不发生互作。

cGAS在固有免疫中的作用也有「双刃剑」的效应，其需要减少对自身DNA的识别，同时又要识别外源病毒的DNA。研究人员进一步用功能实验验证cGAS的定位对其通路的作用，发现cGAS-ΔN的外源表达引起下游IFNβ1和 RSAD2高表达，而将cGAS-ΔN DNA结合位点（C396/397A）突变后则不存在该效应，证实N端结构域对cGAS的定位可影响其识别DNA的效应。

当细胞感受遗传毒性所致的DNA损伤刺激时也可引起cGAS通路的活化。研究人员发现使用H2O2处理WT THP1细胞只引起少量IFNβ1表达，而表达有cGAS-ΔN的THP1细胞则呈现明显的IFNβ1表达增加，使用doxorubicin和PMA（phorbol myristate acetate）作为DNA损伤诱导剂得到类似结果。而当研究人员继续调研该结构域对外源DNA病毒感染时却发现，cGAS-ΔN较cGAS-WT对DNA病毒感染不呈现活化效应增加，而且呈现一定的不敏感性。这些实验证实，N端对cGAS的胞膜定位可避免其移位于胞质，对DNA的损伤产生过度的活化，而该异常定位并不增加其对外源病毒感染的效应。

在最后的分子机制中，研究人员鉴定到R71/R75两个呈正电的鸟氨酸位点参与PI(4,5)P2的结合，而这两个位点R71/75E突变后呈与cGAS-ΔN相似的效应。

本文通讯作者Kagan教授既往对固有免疫的受体分子的定位研究有十分重要的贡献，证实了Toll样受体的调节蛋白TIRAP、TRAM均为膜定位的调节蛋白【8 ,9】。这一次Kagan在cGAS领域再施拳脚，首次发现cGAS为细胞膜定位的蛋白，打破了既往关于其定位的认知。自被发现以来，cGAS一直被作为重要的细胞质DNA感受器进行研究，而这一观念将随本文的出现而被改写。同时本文的发现也提示，cGAS在识别DNA病毒感染后可出现由细胞膜到胞质的转位，该作用背后的调节机制仍有待发掘。

原文链接：

Redirecting?

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参考文献：

1. Sun L, Wu J, Du F, Chen X, Chen ZJ. Cyclic GMP-AMP synthase is a cytosolic DNA sensor that activates the type I interferon pathway. Science 2013;339(6121):786-91.

2. Wu J, Sun L, Chen X, Du F, Shi H, Chen C, et al. Cyclic GMP-AMP is an endogenous second messenger in innate immune signaling by cytosolic DNA. Science 2013;339(6121):826-30.

3. Whiteley AT, Eaglesham JB, de Oliveira Mann CC, Morehouse BR, Lowey B, Nieminen EA, et al. Bacterial cGAS-like enzymes synthesize diverse nucleotide signals. Nature 2019.

4. Eaglesham JB, Pan Y, Kupper TS, Kranzusch PJ. Viral and metazoan poxins are cGAMP-specific nucleases that restrict cGAS-STING signalling. Nature 2019;566(7743):259-63.

5. Du M, Chen ZJ. DNA-induced liquid phase condensation of cGAS activates innate immune signaling.Science 2018;361(6403):704-09.

6. Liu H, Zhang H, Wu X, Ma D, Wu J, Wang L, et al. Nuclear cGAS suppresses DNA repair and promotes tumorigenesis. Nature 2018;563(7729):131-36.

7. Balla T. Phosphoinositides: tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiological reviews2013;93(3):1019-137.

8. Kagan JC, Su T, Horng T, Chow A, Akira S, Medzhitov R. TRAM couples endocytosis of Toll-like receptor 4 to the induction of interferon-beta. Nature immunology 2008;9(4):361-8.

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