導讀

　　人體腸道微生物羣的組成與健康和疾病有關，需要了解各個微生物物種的生物學作用。但人類腸道微生物羣的完整細菌庫仍不明確。通過從11850個人類腸道微生物羣中重建92143個元基因組組裝基因組來鑑定1952個未培養的候選細菌物種。這些未經培養的基因組大大擴展了人類腸道微生物羣的已知物種庫，系統發育多樣性增加了281%。將未研究的非洲和南美樣本的分類提高了200%以上。這些候選物種編碼數百個新的生物合成基因簇，並具有獨特的功能能力，揭示了未培養的腸道細菌多樣性，爲腸道微生物羣的分類和功能特徵提供了前所未有的解決方案。

　　文獻ID

　　題目：A new genomic blueprint of the human gut microbiota

　　譯文：人類腸道微生物羣的新基因組藍圖

　　期刊名：nature

　　年份：2019IF：41.577

　　通訊作者：Alexandre Almeida，Robert D. Finn

　　通訊單位：歐洲生物信息學研究所

　　材料與方法

　　實驗設計

　　從75個不同的研究中檢索了13,133個人類腸道菌羣數據集。樣本主要來自北美（n=6869，52%）或歐洲（n=4716，36%），可用的數據來源於患病患者（n=4323,33％）和成人（n=3053,23％）。通過一系列的計算方法對腸道菌的基因組進行重建。

　　研究成果

　　1、大規模發現未被培養的物種

　　採用SPAdes組裝，13,133個宏基因組裝配中的11,850個產生了可通過MetaBAT進行基因組裝的重疊羣，產生了總共242,836 bins。根據基因組完整性和污染水平，用CheckM評估每個bin的質量（圖1）。基於這些指標，獲得40,029個MAG，完整性>90％和污染50（定義爲完整性-5x污染）。

　　圖1 Check M bin的質量評估

　　a.CheckM評估的由MetaBAT生成的242836個bin的質量指標 b.根據基因組完整性和污染程度重新獲得的bin數。

　　將39,891個近乎完整的MAG匹配到HR數據庫，該數據庫由來自HMP和HGG的2468個分離基因組組成（圖2）。同時比較了RefSeq中的8778個完整細菌基因組與MAGS（圖2b）。在39,891個MAG中，與95%平均核苷酸一致性（ANI）≥60%的MAG標準，可將26,898個匹配到HR數據集，12970個匹配到RefSeq，HR內不同分類羣有很好的覆蓋率（圖3），三個最常見爲Ruminococcus bromii（n=1,255），Alistipes putredinis（n=1,142）和Eubacterium rectale（n=839）。所有這些都是人類腸道的已知定植者，證實這些物種是腸道微生物的常見成員。

　　圖2 成千上萬的宏基因組裝基因組與分離基因組不匹配

　　a 近乎完整（>90%完整性，

　　圖3 人類特異性分離基因組的系統發育多樣性

　　未匹配到HR或RefSeq（圖2b）的接近完整的MAG有11888個（30%）。在估計的物種水平（圖4）上對MAGS進行了去複製，共產生1175個接近完整的元基因組物種（MGS）。

　　圖4 Mash相似性聚類的分析

　　利用這個1,175 MGS的數據集，將分析擴展到QS>50的近乎完整和中等質量的MAG（n=92,143），共發現了2,068個MGS（圖5），代表了人類特異性和參考數據庫中沒有的高質量細菌基因組。

　　圖5 宏基因組物種的質量指標

　　a 完全性分佈和受污染程度 b 編碼MGS基因組中20個標準氨基酸的tRNAs數目 c 基於Mash聚類結構和97％的平均氨基酸同一性閾值，計算所有2,068個MGS的Matthews相關係數（MCC）。

　　2、物種特徵與分佈

　　在人體腸道中鑑定了2,068個MGS，使用UniProtKB的蛋白質搜索來補充CheckM的系統發育推斷方法，94％的MGS（n=1,952）與UniProtKB中的任何分離基因組都不匹配，這代表了未培養的候選物種。98%和94%的UMGS可註釋到門和綱水平，91%可註釋到目水平（圖6a）。大部分的UMGS可能屬於新的科和/或屬。三個最常見的科分別爲：Coriobacteria（20.6%）、Ruminocococaceae（9.9%）和Peptostreptocococococaceae（7.4%），屬爲Collinsella（17.7%）、Clostridium（7.3%）和Prevotella（4.4%）。數據表明，儘管已知腸道微生物羣的定植者，但這些科仍然具有相當大的未經培養的多樣性。Clostridiumn被認爲是高度多型的，系統發育樹表明，該類羣可能屬於29科的121屬。因此，對許多註釋給這個屬的未培養物種的檢測可能反映了當前的分類侷限性，而不是生物信號。

　　圖6 最常見的未培養腸道細菌的分類

　　a 1,952個未分類的元基因組物種(UMGS)的分類組成 b 13,133個元基因組數據集中頻率最高的20個UMGS基因組。

　　考慮基因組覆蓋水平、平均讀取深度和均勻性（圖7），每個基因組的樣本數。在至少31個元基因組樣本中發現了一半的UMGS（圖7c）。將原始13,133元基因組數據集的原始序列與UMGS數據集進行了比較。最常見的UMGS屬於Ruminococcaeae和Faecalibacterium屬。

　　圖7 基因組存在和流行分佈

　　a 深度 b 均勻性 c 在相應的元基因組樣本中檢測到的UMGS數量。

　　將UMGS定位在來自HR數據庫的腸特異性物種中，下文稱爲人腸道參考（HGR）。基於用specI32提取的40個標記基因構建了1,952個UMGS和553個HGR基因組的系統發育（圖8a）。系統發育分析表明，UMGS基因組基於總分枝長度將人腸道細菌譜系的多樣性擴展了281％，其中Firmicutes門的增幅最大（圖8b）。

　　圖8 參考和未培養的人類腸道細菌基因組的系統發育

　　a 系統發育樹（包含屬於人類腸道參考（HGR）的553個基因組，以及1,952個未分類的宏基因組物種（UMGS）） b UMGS提供的系統發育多樣性的增加水平，相對於每個門的完全多樣性（左）和表示爲絕對總分支長度（右）。

　　將每個UMGS和HGR基因組的頻率和豐度與樣本的地理起源相關聯（圖9）。在相對丰度>0.01％時發現來自不同大陸的每個物種的樣品數量（圖9a）。與HGR基因組相比，UMGS在來自非洲和南美洲未經研究的樣本中更爲頻繁。結果表明新發現的一些UMGS更好地代表了這兩個代表性不足羣體的腸道多樣性。

　　圖9 樣本的地理分佈和未培養物種

　　a HGR或未培養物種（UMGS）在樣本中的數量分佈 b 在每個地理區域至少20%的樣本中發現的物種數量 c 按樣本地理位置劃分的讀取比例增加 d 累積曲線描繪了每個大陸的宏基因組樣本數量與檢測到的UMGS數量的函數。

　　根據地理起源對數據進行分區後，來自非洲（n=21）和南美（n=36）的少量數據集的讀取分配分別提高了215%和278%（圖9c）。從每個大陸獲得的樣本數量檢索的UMGS數量建立累積曲線（圖9d）。結果表明，歐洲和北美人口的覆蓋率最高，趨向飽和點。相反，在北美和歐洲以外的樣本中，仍然以一致的速率檢測到新的未培養物種。

　　3、獨特的功能表

　　通過獲得2,505個人類腸道物種（1,952個UMGS和553個HGR），對腸道細菌羣體進行全面而深入的功能鑑定。檢測到200多個編碼糖肽，非核糖體肽合成酶（NRPS）和細菌素的BGC（圖10a）。在UMGS和HGR中檢測到的BGC總量的85%和70%分別代表了新的簇（圖10b）。表明可能存在許多由腸道微生物羣產生的未被發現的天然化合物，具有抗菌和/或生物技術的應用前景。

　　圖10 人類腸道中發現的生物合成基因簇

　　a 次級代謝物生物合成基因簇(BGCs)的數目 b 不符合生物合成基因簇(MIBiG)數據庫的所有BGCs的比例。

　　使用GhostKOALA生成KEGG Orthology（KO）註釋，跟蹤UMGS和HGR集合中特定功能類別的差異丰度。在全球範圍內，通過根據分類組成分析全球定位系統的功能，觀察到一個很好的分類，特別是類桿菌和變形桿菌，顯示了非常獨特的功能特徵（圖11）。

　　圖11 未培養的物種具有獨特的功能

　　a 基於HGR和UMGS基因組特性的主成分分析 b GO功能分析

　　在Go條件下，UMGS內丰度低的基因與抗氧化和氧化還原功能特別相關（圖5b），表明對活性氧物質的耐受性較低。相反，根據GP結果，除了各種其他功能外，觀察到UMGS基因組中編碼鐵-硫和離子結合的基因的富集。在缺氧條件下，鐵（Fe2+）的亞鐵形式最爲豐富，它同時有利於硫和氮配體。表明，UMGS可能更好地適應胃腸道的特定龕位，尤其是低氧張力或高鐵濃度，這兩種情況都會在其環境中產生高水平的亞鐵離子。總的來說未培養物種具有特定的功能，可以解釋其難以捉摸的性質，同時提高對當前從純細菌培養中獲得的參考基因組集合中所缺乏的生物學特性的認識。

　　研究結論

　　1、從11850個人類腸道菌羣基因組中，鑑定出1952種未在實驗室培養的腸道細菌。

　　2、新發現的腸道細菌，將已知腸道細菌的微生物多樣性增加了281%。

　　3、北美和歐洲人羣具有大量相同的腸道微生物菌種。少數南美和非洲人羣的數據集卻出現了前兩種人羣所不具有顯著的多樣化特徵。

　　4、未培養的細菌基因組，編碼數百種新的生物合成基因簇，並具有獨特的功能。

　　亮點

　　這項研究中，研究者們利用了最全面的胃腸道公共數據庫，基於宏基因組學的方法，通過各種計算方法對腸道菌的基因組進行重建。並利用一系列計算工具補充分析，探索人體腸道菌羣，爲後續胃腸道疾病的診斷和治療提供了重要的參考基礎。

　　供稿：陳夏婷

　　編輯：魯淑妮

　　轉自： 銳翌基因

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