Science長文 | 楊茂君團隊首次獲得高等生物ATP合酶的完整結構——附論文背後的故事
撰文丨Andy
責編丨兮ATP合酶（又稱為F0F1-ATP酶或複合物V），是人體線粒體內最重要的分子機器，負責將生物外界攝入的食物中的能量轉化到機體細胞所能利用的能量儲存模塊ATP分子中去。人體95%的ATP由它所合成。為了解釋ATP合酶的工作機理，Paul D. Boyer（哀悼丨提出ATP合酶工作原理的巨擘、諾獎得主Paul Boyer逝世）提出「旋轉催化假說」。1994年，英國MRC結構生物學家John Walker通過X射線衍射技術獲得了2.8 ?解析度下的牛心線粒體F1-ATP酶晶體結構（目前《細胞生物學》教材的經典內容），清晰地表明了F1上的3個β亞基的構象明顯不同，分別為結合ATP的緊密態、ADP即將釋放的開放態以及無底物結合的鬆散態，從而有力地支持了「旋轉催化假說」【1】。2019年6月14日，清華大學生命科學學院楊茂君教授研究團隊在Science雜誌發表題為Cryo-EM structure of the mammalian ATP synthase tetramer bound with inhibitory protein IF1的研究長文，突破性地發現並解析了哺乳動物ATP合酶四聚體的構成形式和高解析度結構。首次獲得了高等生物ATP合酶的完整結構，提出了細胞內調控ATP合酶的分子機理，為進一步理解哺乳動物ATP合酶的亞基組成、調控機制、以及其對線粒體形態的影響等提供了重要的結構基礎，同時也為以後教科書的更新提供了重要素材。
楊茂君教授自從2008年在清華組建研究團隊起，就一直在線粒體呼吸鏈研究領域深耕，並取得了一系列重要研究成果，首次在原子水平上闡明了線粒體呼吸鏈超級複合物的結構【2】，隨後發現了線粒體呼吸鏈超超級複合物的存在，解析了這一目前世界上所解析的最大也是最複雜的哺乳動物超大膜蛋白分子機器的結構，並部分闡明了它的作用機制【3,4】（詳見BioArt報道：清華新聞發布會(推介)介紹線粒體呼吸鏈超級複合物研究成果）。
在上述課題的進展過程中，楊茂君團隊持續性地發現含量極其稀少的具有H型分子結構的顆粒的存在，進一步地分析表明這些顆粒應該是一種ATP合酶四聚體複合物，對應於之前CN-PAGE中的高分子量條帶。隨後，設計了一整套全新的、完備的純化路線，獲得了大量高純度、高均一性的蛋白樣品並製備了大量冷凍電鏡樣品。經過檢查後，發現部分樣品質量非常好，適合收集數據。
因為該四聚體分子量大約為2.8兆道爾頓，呈現H狀分布，體積巨大，數據計算過程中需要大量計算資源。基於此，決定採用一種全新的計算方法，將四聚體中四個ATP合酶分子分別重新居中然後單獨挖出來，而將X型中對角線上構象相似的分子合併。最終獲得了主要分為兩類的大量構象一致的單個ATP合酶的顆粒。在其後的計算中逐步將這兩類構象不同的複合物解析度提高到了原子解析度水平。6.2 ?解析度下的整體結構表明兩個V形的ATP合酶二聚體近似垂直地排列在一起形成C2對稱的結構，其中有六個位點對二聚體聚合成四聚體起主要作用。從這一較低解析度複合物中提取並解析的3.34和3.45?解析度的亞結構則對應於E和DP兩個旋轉態。兩個狀態中的亞基是完全相同的，均含有以前研究發現的18種亞基和一個新發現的k亞基（基於酵母的命名方式，氨基酸組成並未鑒定出來）。該結構是目前發現的最完整的哺乳動物ATP合酶結構，兩種不同構象的結構不僅能夠完美的解釋哺乳動物ATP合酶如何合成ATP分子，而且還鑒定了各個亞基在複合物中的位置和功能。
單個ATP合酶分子機器長得跟我們常見的發電機非常類似。在其跨膜區有一個由8個C1亞基構成的類似於發電機線圈的結構，而跨膜區其它亞基共同構成基座穩定這一桶狀結構。以往生化研究表明，在線粒體膜間隙和胞質間的線粒體內膜兩側存在巨大的質子濃度差。而這一質子濃度差是由細胞內通過消化食物中所獲得的能量分子上的高能電子在通過線粒體電子傳遞鏈蛋白複合物最終傳遞給我們呼吸所吸收的氧氣分子上生成水的過程中，逆質子濃度梯度從線粒體胞質中泵到線粒體膜間隙中去的。我們平常呼吸進入體內的氧氣大約有90%左右會在這一過程中被消耗掉。線粒體膜間隙的質子會在內膜兩側的質子濃度差所帶來的電勢的驅動下沿著8個C1亞基形成的桶狀結構外圈環繞一圈後流入線粒體基質，質子的流動會帶動這一結構在細胞膜內轉動進而通過連接的桿狀結構驅動基質側的三個催化活性中心在ADP上添加一個磷酸基團，依次合成ATP分子。每8個質子流過會驅動桶狀結構轉動一圈，同時會驅動三個活性中心各合成一個ATP分子。有意思的是在酵母中是由10個C1亞基形成的桶狀結構，所以需要10個質子流過才能合成3個ATP分子，而植物中是14個C1亞基形成桶狀結構，故而合成效率是14個質子流過才能合成3個ATP分子。這說明高等生物中能量的利用率大大提高了。物理學告訴我們，所謂電流就是電子在導線中的同向位移，而電子設備在電流作用下做功。同理，在我們的線粒體中，質子環繞ATP合酶C-ring運動促使其頭部做功，合成ATP分子。
基於結構，楊茂君團隊發現ATP合酶四聚體很可能被至少三種機制抑制。首先，在線粒體基質一側，IF1蛋白會將其N端深深的插入到一個ATP合酶具有催化活性的圓形的腦袋中間，跟連接跨膜區和腦袋的桿結合，而其C端會形成一個長的螺旋。最有意思的是這個螺旋會在質子濃度的調節下形成各種不同的聚合狀態。當質子濃度升高的時候它會形成二聚體，進而將ATP合酶四聚體中靠近一側的兩個腦袋給拉住，抑制ATP合酶活性中心的運動，從而使其不能合成ATP分子。當質子濃度降低時，IF1蛋白會形成四聚體或者高聚體，從而將其N端從ATP合酶的腦袋中抽出來，解除這種抑制，ATP合酶變成有活性的狀態，進而合成ATP。
總之，這一研究成果不僅首次發現、鑒定並解析了線粒體內這一最重要的蛋白超級複合物的完整結構，修正了以往科學發現中的錯誤認識，為人們深刻理解線粒體是如何合成我們維持生命所必需的能量分子ATP提供了全新的視角，同時也為我們深刻理解線粒體呼吸鏈相關疾病的預防和治療打下了良好的基礎，該研究將為人類的身體健康帶來重大而深遠的影響。
附：論文背後的故事
單顆粒冷凍電鏡技術是近幾年發展起來的一項幫助科學家在原子水平上看清生物學大分子內部構成的利器，2017年三位科學家因開發這一技術而獲得諾貝爾化學獎。清華大學生命科學學院楊茂君教授師承於我國著名分子生物學家王琳芳院士和饒子和院士，自2001年起從事X-射線生物大分子晶體學研究。2008年回國加入清華大學後一直致力於人體能量代謝過程分子機理的研究。2013年冷凍電鏡技術突破後，楊茂君教授敏銳的意識到這一技術突破對自己所研究的領域乃至對結構生物學未來發展趨勢的巨大推動作用，毅然決然的選擇了冷凍電鏡技術作為主要研究手段。近年接連來取得了多項重大研究成果，首次在原子水平上闡明了線粒體呼吸鏈超級複合物的結構，並敏銳的發現了線粒體呼吸鏈超超級複合物的存在，解析這一目前世界上所解析的最大也是最複雜的哺乳動物超大膜蛋白分子機器的結構，並部分的闡明了它的作用機制。2018年8月25日，星期六，在例行研究室科研組會上劉天涯同學在線粒體呼吸鏈電子傳遞鏈研究進展報告過程中，楊茂君教授發現了一類H型的分子結構的存在。此類蛋白數目只有500多個分子，占所研究的55萬線粒體呼吸鏈蛋白總數的0.09%。正是憑藉這500多個含量極其稀少的顆粒，實驗室博士研究生張來幸同學通過計算初步得到了一個以前從未被發現的蛋白超級複合物極低解析度結構，楊茂君教授在對這一結構進行深度分析後發現這一分子應該是一類的ATP合酶四聚體。ATP合酶是人體線粒體內最重要的分子機器，在機體內負責將生物外界攝入的食物中的能量轉化到機體細胞所能利用的能量儲存模塊ATP分子中去。人體95%的ATP由它所合成。1997年應該結構生物學家John Walker曾因解析這一蛋白複合物頭部催化結構域的分子結構而獲得諾貝爾化學獎。在近六十年的研究過程中，科學家初步揭開了這一重要分子機器的神秘面紗，普遍認為此類分子機器可以在線粒體內膜形成的脊上以多聚二聚體的形式呈現雙排線狀排布，而楊茂君教授發現的這一穩定四聚體結構與以往的研究存在巨大差異。為研究清楚這一分子機器的作用機理，楊茂君教授安排實驗室博士後，目前國際上生化水平最高的青年科學家之一的谷金科博士開展了針對這一新發現的超級複合物的生化研究。不負眾望，谷金科博士在深度調研了以往針對ATP合酶的生化研究之後，設計了一整套全新的、完備的純化路線，獲得了大量高純度、高均一性的蛋白樣品並製備了大量冷凍電鏡樣品。經過檢查後，發現部分樣品質量非常好，適合收集數據。得知南方科技大學冷凍電鏡中心的兩台高端300千伏冷凍電鏡即將安裝完成，楊茂君教授果斷的跟南方科技大學冷凍電鏡中心主任王培毅教授提出可以用珍貴的、具有重大研究意義的樣品幫其測試新安裝的電鏡，王教授在仔細核查了樣品檢查情況後給予了高度評價並欣然同意。9月30日，實驗室線粒體小組成員張來幸同學攜帶寶貴的樣品登上了開往深圳的列車，並於10月1日正式開展了數據採集工作。在隨後的一個多月的時間裡，在由於電鏡狀況百出的情況下，張博士在王教授的幫助下克服種種設備故障所帶來的困難，採集到了四萬多張電鏡圖片，初步篩選後得到了大量ATP合酶四聚體的原始數據。在數據採集過程中，楊茂君教授毅然決然的拿出研究組本就少得可憐的科研經費中的一大部分，在實驗室成員田學遠博士的指導下搭建了研究室自己的GPU計算集群。因為該四聚體分子量大約為2.8兆道爾頓，呈現H狀分布，體積巨大，數據計算過程中需要大量計算資源，而清華大學的計算資源由於許可權問題，基本上排不上。隨後，楊教授將包括自己在內的線粒體呼吸鏈研究小組的四位同學全部投入到這一超級複合物的計算過程中。由於該結構過於巨大，且存在多種構象，在嘗試了幾乎所有能夠利用的計算程序和方法之後，依然無法得到該分子機器的高解析度結構。在對初步計算結果的深度分析之後，楊教授又一次敏銳的發現在該H型的結構中單個ATP合酶複合物呈現X型的交叉構象相似。在初步比較後，楊教授決定採用一種全新的計算方法，將四聚體中四個ATP合酶分子分別重新居中然後單獨挖出來，而將X型中對角線上構象相似的分子合併。這樣做的好處不僅能夠做到化整為零，極大的縮小了計算中的分子尺度，而且還能把相似的分子合併以提高樣品單位數量。在隨後的一周時間裡，研究小組的另一位優秀博士後宗帥博士（2018年吳瑞獎學金獲得者）在嘗試了多種方法之後，最終實現了楊教授的設想，獲得了主要分為兩類的大量構象一致的單個ATP合酶的顆粒。在其後的計算中逐步將這兩類構象不同的複合物解析度提高到了原子解析度水平。近三十年來，世界上多位非常優秀的科學家持續開展了針對ATP合酶的結構生物學研究，取得了大量突破性的重大研究成果。但是在以往的生化、遺傳及結構生物學研究中，科學家一直沒有研究清楚哺乳動物ATP合酶到底是由多少個蛋白亞基構成？雖然John Walker早在1997年就以針對牛心來源的ATP合酶胞外區催化結構域的研究而獲得諾貝爾化學獎，但是ATP合酶完整結構，尤其是跨膜區的結構一直沒有得到很好的解析，具體構成也未知。此外，科學家對ATP合酶在線粒體內到底是如何進行排布，其活性如何進行調控也是一知半解。楊茂君教授在仔細分析了所得到高解析度ATP合酶四聚體結構之後，又雙叒叕一次敏銳的發現單個哺乳動物ATP合酶是由19種不同的亞基，共有30個蛋白來構成的一個超級複合物，而不是以前研究發現的18種亞基。該結構是目前發現的最完整的哺乳動物ATP合酶結構，兩種不同構象的結構不僅能夠完美的解釋哺乳動物ATP合酶如何合成ATP分子，而且還鑒定了各個亞基在複合物中的位置和功能。總結：在本課題的研究過程中，充分發揮了實驗室近年來在線粒體呼吸鏈研究過程中所積累的經驗和研究數據。課題進展神速與線粒體呼吸鏈研究小組成員的優良素質和日以繼夜的努力工作分不開的。ATP合酶四聚體的發現過程是偶然中的必然，是長期在這一重要研究領域內的深耕細作的必然結果，該工作的完成與完備的實驗規劃，統籌安排及人員合理分配密切相關。最後，可以說，敏銳的洞察力、想像力和強大的執行力，以及在某一重要研究領域內的孜孜以求、深耕細作是科研工作可以持續不斷取得重大進展的基本保障。啟示：生物大分子單顆粒冷凍電鏡相機技術的突破，為生命科學的研究推開了一扇新的大門，使得這一技術不僅僅在解析生物大分子結構方面變得越來越容易，而且成為了發現和鑒定新的生物大分子超級複合物的一項重要手段。比如曾經在2017年的時候僅僅憑藉發現的佔比不到1.5%的電子傳遞鏈超級複合物顆粒中發現了環狀的超超級複合物；而此次，發現的ATP合酶超超級複合物在最初的時候佔比僅為0.09%。在可以預見的不遠的將來，相信會有更多的、以前沒有被發現的新的生物大分子組合形式的超級複合物被鑒定出來，這一手段正在逐步取代以往通過生化、遺傳等等手段發現超級複合物的過程。原文鏈接：
Cryo-EM structure of the mammalian ATP synthase tetramer bound with inhibitory protein IF1
參考文獻：1. Stock, D., Leslie, A.G.W. and Walker, J.E. (1999) Molecular architecture of the rotary motor in ATP synthase. Science 286, 1700-17052. Gu, Jinke et al., (2016). The architecture of the mammalian respirasome. Nature. 537.10.1038/nature19359.3. Meng, Wu et al., (2016). Structure of Mammalian Respiratory Supercomplex I1III2IV1. Cell. 167. 1598-1609.e10. 10.1016/j.cell.2016.11.012.4. Guo, Runyu et al,. (2017). Architecture of Human Mitochondrial Respiratory Megacomplex I 2 III 2 IV 2. Cell. 170. 10.1016/j.cell.2017.07.050.推薦閱讀：
