新型分子標記——SRAP與TRAP及其應用轉貼自：科技長廊傳統作物育種過程主要依賴於植株的表型選擇（phenotypic selection），性狀選擇效果難以提高。遺傳標記特別是基於DNA多態性的分子標記在作物遺傳連鎖圖譜構建、重要性狀基因標記定位與克隆、種質資源遺傳多樣性與系統發育分析、品種指紋圖譜繪製及遺傳純度檢測等方面廣泛應用，尤其是分子標記輔助選擇(molecular marker-assisted selection, MAS)為育種工作提供了極大方便，可顯著提高育種的選擇效率與育種預見性。1 現有的分子標記 目前分子標記技術主要有RFLP、RAPD、ISSR、 AFLP、 SSR、SCAR和單核苷酸多態性 (SNP)、表達序列標籤 (EST)等。由於PCR技術的優點，基於PCR的標記體系類型多樣，應用廣泛，但各自的複雜性、可靠性與遺傳信息不同。如RAPD方法簡單、成本低，但重複性較差、檢測位點不多；SSR多為共顯性、重複性好，但位點較少、引物開發成本高；AFLP譜帶多，但分析程序複雜、成本高，有時要用到同位素，而且甲基化敏感的限制酶由於基因組DNA的甲基化可導致「假多態性」產生，識別AATT位點的MseI酶常會引起一些物種基因組中標記分佈不均衡；多數情況下，RAPD與AFLP標記測序需要克隆，增加了工作量。2 SRAP標記體系分析原理與方法 相關序列擴增多態性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)是一種新型的基於PCR的標記系統，由美國加州大學蔬菜作物系Li與Quiros博士於2001年提出，又叫基於序列擴增多態性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP）。2.1 SRAP標記引物設計原理 引物設計是SRAP分析的核心。SRAP標記分析共有兩套引物。在一組正向SRAP引物中使用「CCGG」序列，其目的是使之特異結合可譯框（ORFs）區域中的外顯子。研究表明外顯子一般處於富含GC區域，如擬南芥2和4號染色體的全序列中，外顯子CG比例分別為46.5%和44.08%，而內含子中則為 32.1%和33.08 %；而且除著絲粒區域有較低基因密度外，基因幾乎平均分佈在這兩個染色體上。從GenBank中隨機選擇20個BAC序列，發現約66%的CCGG序列位於這些克隆中的外顯子內。據統計，擬南芥約1/3基因組外顯子位於2、4號染色體上。運用CCGG序列就可特異擴增出包含這些組分的序列。 當然，由於外顯子序列在不同個體中通常是保守的，這種低水平多態性限制了將它們做為標記的來源。由於內含子、啟動子和間隔序列在不同物種甚至不同個體間變異很大，富含AT的區域序列通常見於啟動子和內含子中，SRAP中使用的反向引物的3′ 端含有核心AATT，以特異結合富含AT區，這就使得有可能擴增出基於內含子與外顯子的SRAP多態性標記。 2.2 引物設計與應用 引物大小和引物組合是成功進行SRAP分析的關鍵。SRAP-PCR反應體系中使用兩個引物：17鹼基正向引物（F-primer）和18鹼基反向引物(R-primer)；早期反向引物在3』端選擇性核苷前多一個C（19個）；使用同位素檢測時引物可用33P-ATP標記。正向引物含有一段14鹼基的核心序列（core sequence）：5′端前10個鹼基為「填充」序列（filler sequence），無任何特異組成，接著為CCGG序列；隨後為3′ 端的3個選擇性鹼基，選擇性鹼基的變化與相同核心序列組合成一套正向引物。反向引物的組成與正向引物類似，但「填充」序列後連接的為AATT；AATT序列後為3個選擇性可變鹼基，位於引物3′ 端。當然，構建正向與反向引物的總體要求是它們不形成髮夾結構及其他二級結構，且CG含量為40%－50%，且兩者「填充」序列在組成上必須不同，長度為10或11個鹼基。 目前文獻中報道的部分標準引物序列如下： 正向引物Forward primer 反向引物Reverse primerme1:5′TGAGTCCAAACCGGATA-3′ em1:5′GACTGCGTACGAATTAAT-3′me2:5′TGAGTCCAAACCGGAGC-3′ em2: 5′GACTGCGTACGAATTTGC-3′ <>< p="">me3:5′TGAGTCCAAACCGGAAT-3′ em3: 5′GACTGCGTACGAATTGAC-3′me4:5′TGAGTCCAAACCGGACC-3′ em4: 5′GACTGCGTACGAATTTGA-3′me5:5′TGAGTCCAAACCGGAAG-3′ em5: 5′GACTGCGTACGAATTAAC-3′ me6:5′TGAGTCCAAACCGGTAA-3′ em6: 5′GACTGCGTACGAATTGCA-3′ me7:5′TGAGTCCAAACCGGTCC-3′ em7: 5′GACTGCGTACGAATTCAA-3′me8:5′TGAGTCCAAACCGGTGC-3′ em8: 5′GACTGCGTACGAATTCTG-3′em9: 5′GACTGCGTACGAATTCGA-3′ em10: 5′GACTGCGTACGAATTCAG-3′em11: 5′GACTGCGTACGAATTCCA-3′實驗表明，用單引物擴增只能擴增幾條大約0.5~1kb的片段；使用較短引物，10鹼基RAPD引物，以及含有SRAP引物核心序列的14－15鹼基大小的引物，這些引物組合可得到多種擴增片段，但是擴增產物不穩定，特異性不強；20-22鹼基引物放射自顯影的結果背景太強；合適的引物大小在17－18鹼基。 2.3 SRAP-PCR擴增 反應模板多數是基因組DNA，也可以是cDNA。在一個標準PCR反應體系中，0.2mmol/L dNTPs,1.5mmol/L Mgcl2,0.3μmol/L引物，1U Taq酶。SRAP-PCR反應採用復性變溫法：開始94℃變性5min；反應前5個循環在94℃ 1min，35℃ 1 min，72℃ 1－2 min條件下運行；之後30－35個循環復性溫度提高到50℃，最後延伸5~7 min。 前5個循環復性溫度設為35℃ ，主要是考慮到低的復性溫度能確保兩個引物與靶DNA部分配對；隨後循環中復性溫度升到50℃，可保證前5個循環的擴增產物可在餘下循環中進行指數式擴增；如果復性溫度在40個循環中都保持在35℃，擴增片段重複性將很低。2.4擴增產物檢測與片段測序 擴增產物在變性聚丙烯醯胺凝膠上分離，通常膠板35 cm×43cm，厚度0.8mm，每孔加樣 8－20 微升，以保證單條帶足夠量回收。可使用同位素，也可採用銀染技術；用2.0%的瓊脂糖凝膠也可分析多態性，但分辨的條帶較少。對標記測序有可能獲得更多的遺傳信息。由於多數SRAP產生高強帶，很少有重疊，而且引物較長，故比AFLP易測序。獲得的SRAP標記差異片段，從膠上割下、回收後，用相應引物直接測序，必要時可採用克隆測序。2.5 SRAP標記特徵 由於在設計引物時正反引物分別是針對序列相對保守的編碼區與變異大的內含子、啟動子和間隔序列，因此，多數SRAP標記在基因組中分佈是均勻的，通過利用RIL系構建的遺傳連鎖圖也說明瞭這一點。同時發現在130個SRAP標記中，約20%為共顯性，這種高頻率的共顯性則明顯優於AFLP標記。利用同一引物組合，從甘藍類不同作物中（包括花椰菜、青花菜等）可獲得多個SRAP標記。單個組合在每個個體中可檢測到至少10條多態性譜帶，其中一些為作物特異的；在不同的實驗中多態性條帶重複性極好。 SRAP標記測序顯示多數標記為外顯子區域。25條多態性帶中16條（64%）序列GC含量超過35%，表明可能是外顯子部分；Blast搜索表明60%條帶與已知基因序列高度一致，這就確認了SRAP產生的多數標記包含了可譯框中的外顯子。測序還表明SRAP多態性產生於兩個方面：由於小的插入與缺失導致片段大小改變，而產生共顯性標記；核苷酸改變影響引物的結合位點，導致顯性標記產生。<>< p="">3. TRAP標記原理與方法 靶位區域擴增多態性 (target region amplified polymorphism，TRAP)也是一種新型的基於PCR標記，由美國農部北方作物科學實驗室Hu與Vick於2003年提出。與SRAP、RAPD和AFLP等標記技術無須任何序列信息即可直接PCR擴增不同，TRAP技術是基於已知的cDNA 或EST序列信息。目前已獲得許多物種基因組序列的豐富信息，包括人類、擬南芥，以及重要作物水稻和多種微生物的基因組序列草圖繪製成功，有大量的EST序列可供使用，從而使得可以利用生物信息學工具和EST資料庫信息產生出許多靶基因序列的TRAP多態性標記，而且極易將性狀與標記相關聯。TRAP技術是從SRAP技術改進而來的。SRAP使用兩個任意引物；而TRAP是使用長度為16~20核苷的固定引物（fixed primer）與任意引物(arbitrary prime)，固定引物以公用資料庫中的靶EST序列設計而來；任意引物與SRAP所用的一樣，為一段以富含AT或GC為核心、可與內含子或外顯子區配對的隨機序列。固定引物的設計步驟為：從EST資料庫中鑒別所需序列，再採用有關引物設計軟體（如Primer3等） 設定核苷酸序列合理長度（18鹼基）與最適、最大和最小Tm值（53、55、50℃），最後選定最適的引物; 任意引物設計完全同SRAP技術。TRAP-PCR反應條件與SRAP-PCR完全一致。每次TRAP-PCR反應在6.5%聚丙烯醯胺測序膠可產生50－900bp的片段30-50 個。 4 應 用 SRAP分子標記系統最早是在蕓薹屬作物開發出來。目前已在其他作物如馬鈴薯、水稻、生菜、油菜、大蒜、蘋果、櫻桃、柑橘與芹菜中也成功擴增。TRAP技術是在向日葵中開發的，目前已成功應用於其他作物如水稻、菜豆、大麥、小麥、甜菜。主要用於種質資源的鑒定評價、遺傳圖譜的構建、重要性狀基因標記、gDNA與cDNA指紋分析乃至圖位克隆等方面。4.1種質資源的鑒定評價 由於在不同物種、不同個體間具有一定的多態性，SRAP技術也成功應用於種質鑒定與評價工作中。Ferriol等（2003）對甜瓜（Cucurbita pepo）的2個變種69份類型代表性材料遺傳多樣性進行了SRAP、AFLP標記與形態學分析，結果表明，與形態學變異及類型的進化歷史一致性方面，SRAP標記提供的信息比AFLP標記更優良；11個SRAP引物組合獲得88條可重複的條帶，平均8條，其中64條（72.7%）為多態，大小在154-653bp 之間；測序發現多個標記序列與已知cDNA或EST高度同源。另外還利用SRAP標記對筍瓜（C.maxima）19 份種質及8份南瓜屬材料遺傳多樣性進行分析，24個引物組合產生的114個標記中多態性佔33%，雖然低於RAPD比例，但聚類分析與主坐標分析表明，SRAP標記分析可將材料按照使用類型（食用、飼用、觀賞用）來分組。因此，在對育種目標性狀的評價方面，明顯優於RAPD標記。野牛草（Buffalograss）生長緩慢、耐旱、耐瘠、抗蟲，倍性多樣，遺傳基礎廣泛。Budak等利用SRAP標記分析了buffalograss的43個基因型遺傳多樣性，結果也表明SRAP是一個評價遺傳多樣性、品種鑒定和系統發生的有效工具。 向日葵屬野生種在栽培品種遺傳改良方面很有價值，對於重要病害，尤其是霜黴病是很好的抗源，但大部分野生種是多年生，從野生種中鑒定基因非常困難。Hu等設計了與向日葵EST資料庫中編碼富含亮氨酸重複（LRR）類似蛋白序列配對的固定引物，利用TRAP標記分析，對向日葵屬16個野生種及其2個雜交種的遺傳變異性進行評估。結果表明TRAP標記可用於評估向日葵的遺傳多樣性，材料的聚類結果與經典分類相一致；其中一個TRAP引物結合到與抗病性有關的基因序列。表明TRAP技術將在種質基因型鑒別和重要目的農藝性狀的基因標記方面存在廣泛的應用前景。 4.2 遺傳圖譜構建 利用collard × cauliflower形成的RIL86個羣體，構建了由130個SRAP、120個AFLP標記組成的遺傳圖譜。類似AFLP標記，SRAP均勻分佈平衡在9個重要連鎖羣上。高頻率共顯性與在基因組中均勻分佈的特性將使其優於AFLP標記而成為一個構建遺傳圖譜的良好標記體系。 4.3 繪製基因組轉錄圖譜（transcriptome map）轉錄圖譜（transcriptome map）是進行比較基因組學研究極為有效手段。利用基於PCR的cDNA-SRAP分析來檢測編碼區的多態性將簡便、高效、快捷。利用花椰菜DH植株與青花菜雜交產生的F2羣體88個單株，使用48引物組合，從88個cDNA中檢測到281個多態性cDNA -SRAP標記，平均每個引物對產生6個，21.1%為共顯性；構建了由247個標記組成的轉錄圖譜。利用這個圖譜，成功進行了甘藍類蔬菜作物與擬南芥基因組的基因排列與組成分析，發現這兩類基因組的廣泛同一性，在190個多態性cDNA-SRAP標記中，共有169個相似序列；這種同一性集中在某些染色體片段而非整個染色體上；甘藍中大多數重複區段集中對應於擬南芥1號與5號染色體，而不是2號與4號染色體。 4.4 重要性狀基因標記 重要農藝性狀基因緊密連鎖標記的獲得，將可進行性狀分子標記輔助選擇，提高育種的選擇效率與預見性，加快新品種的選育進程。常用的標記作圖羣體有F2、BC1、DH、RIL等，標記策略有BSA、NIL以及GRA等。BoGLS-ALK基因是十字花科中調節脂肪族芥子油糖苷脫飽和基因。利用RIL羣體，採用SRAP技術，將該基因定位到連鎖羣L1，距顯性標記SRAP133 1.4cM。Li等於2003年在大白菜中也發現了一個與雄性不育基因有關的SRAP標記，在油菜中篩選到一個與Rf連鎖的SRAP標記，在芹菜中獲得一個與病毒抗性基因緊密連鎖的SRAP標記。4.5 SRAP標記測序與基因克隆多數SRAP標記包含了可譯框中的外顯子，這為特定性狀基因的分離克隆提供了極大方便。進一步測序與Blast分析發現，通過RIL羣體獲得BoGLS-ALK基因的顯性標記SRAP133 與擬南芥中BAC克隆F4C21中一未知基因的可譯框高度同源，該基因位於5號染色體上，此基因座已經定位了一個去飽和基因。據此推測標記SRAP133也在這個基因內部。 綜合運用擬南芥相關基因序列信息，應用SRAP技術對青花菜BAC克隆測序，最終克隆了芥子油糖苷合成途徑中一關鍵基因BoGLS-ELONG。 Li等利用SRAP技術獲得一個與BoGLS-ALK基因共分離的標記，再用此標記序列來篩選青花菜BAC文庫的一個BAC克隆，成功分離到BoGLS-ALK基因；並通過遺傳轉化導入擬南芥，進行了該基因的功能分析。同時正在從結球白菜的花粉母細胞、減數分裂期的花蕾分離出mRNA，進行cDNA的SRAP指紋圖譜分析，以期克隆一些特異表達的基因，並初步獲得PMC特異表達的基因。<>< p=""><>< p="">
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