1、人黑色素瘤中BDCA-3+ SDC水平與整體存活率的提高相關。

我們之前的工作發現了8個基因的「SDC標籤」，它來源於SDC與小鼠腫瘤內所有其他髓系群體的直接比較(圖1A)。 我們使用這種SDC基因標籤來評估黑色素瘤樣本譜中與轉移性黑素瘤數據相關的臨床結果數據的SDC數目，並發現六個「SDC標籤」基因從轉移時起就與增加的OS有顯著的個體關聯(補充表1)。 此外，在Kaplan-Meier分析中，我們將每個樣本的整個標籤以66%的嚴格度分為「高」或「低」表達，我們發現高表達與OS的增加顯著相關(Fig. 1b)；在33%和50%的嚴格度下觀察到類似的相關性(補充圖1A)。 腫瘤基因組圖譜(TCGA)黑色素瘤數據集(補充圖)中概述了SDC基因標籤與OS增加的相關性 (Supplementary Fig. 1b)。進一步發現腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)類型的層組與SDC基因標籤高度相關（Fig.1C） 。 此外，使用SDC和非刺激髓樣細胞(NSMs)特徵比值的基因標記的表達(代表刺激和抑制性髓細胞群體的相對豐富度)也顯示與OS和T細胞浸潤增加有很強的相關性(補充圖1C-E)。 這些數據表明，腫瘤中SDC的相對水平與OS的增加有關。

2、瘤內SDC丰度預示抗PD-1免疫治療的反應性。

腫瘤SDC最初被定義為具有向T細胞交叉呈現腫瘤抗原並刺激T細胞的能力，並在小鼠模型中被證明是產生較好的抗PD-1反應所必需的。 因此，我們尋求確定SDC水平是否與T細胞檢查點阻斷劑治療的有效性有關，預計該治療將可能釋放更多的CD8+T細胞控制腫瘤。 為了將這一分析擴展到黑色素瘤患者，並更廣泛地確定抗PD-1免疫治療反應所需的免疫成分，我們分析了兩組獨立的活組織切片或轉移性黑色素瘤患者手術切除的腫瘤活檢(組A：n=33，包括已經接受各種免疫治療的患者；組B：n=23，都是抗PD-1免疫治療前的；補充表2)。 活組織切片消化成單細胞懸液，隨後用流式細胞術和RNA測序(rna-seq)進行分析，同時跟蹤患者的臨床結果以及抗PD-1免疫治療的反應性。 患者被分為「無應答者」組，定義為病情穩定或進展的組，或「應答者」組，定義為對抗PD-1治療有部分或完全應答者(見方法)。 我們設計了一個全面的流動面板來定量人體腫瘤中的免疫浸潤(Fig. 1d–f and Supplementary Fig. 2a,b)，雖然我們發現黑色素瘤患者免疫浸潤的數量存在異質性，但總免疫浸潤與抗PD-1免疫治療的反應性之間沒有明顯的相關性(圖1D)。

相反，TME內的多個髓細胞系傾向於對免疫治療有反應 (Fig. 1e,f)。 CD14（-）腫瘤相關巨噬細胞(TAMS)在抗PD-1治療反應患者中呈增加趨勢，但這僅見於一個群組(圖1E)。 B組中CD14+細胞數量高對抗pd-1免疫治療的響應有不好的預後，而在組A中，CD14+CD16+單核細胞可以有效地從CD14+CD16 - TAMs中分離出來，腫瘤內單核細胞水平升高，比TAMS更明顯，對抗PD-1免疫治療有負的預後價值(圖1e)。 此外，BDCA-1+DC(CDC2s)在2個群組中均未顯示與應答者狀態相關的顯著變化 (Fig. 1f)。有趣的是，在總抗原呈遞細胞（APCs; gating on CD19–HLA-DR+ cells）中，BDCA- 3+ DCs（通過CLEC9a染色進一步證實哪些是cDC1）的高比例強烈預測了兩組黑素瘤患者對抗pd -1治療的反應的高比例強烈預測了黑色素瘤患者對抗pd-1治療的反應(Fig. 1f)

3、FLT3LG表達與腫瘤中SDC水平相關

鑒於SDC與患者預後和抗PD-1免疫治療反應性有很深的關聯，我們尋求確定控制腫瘤中保護性骨髓細胞水平的細胞和分子機制。 包括腫瘤SDC在內的cDC1s形成的細胞因子是FLT3L，但這種細胞因子在腫瘤中的內源性來源尚不清楚。 利用他們的黑色素瘤數據集（包含來自腫瘤活細胞總數的配對流式細胞術和RNA-seq數據）(組A；補充表2)，我們發現在腫瘤中BDCA-3+DC水平與FLT3LG的表達顯著相關(圖 1g)。 我們證實了腫瘤中SDC水平與FLT3LG表達之間的這種相關性，利用SDC基因標籤來估計公開的TCGA黑色素瘤數據集中的SDC水平。 FLT3LG高表達(中位分裂)的TCGA黑色素瘤樣本明顯增加OS，這與FLT3LG在腫瘤SDC控制中的重要作用一致。 這些發現表明，控制tme中的細胞因子flt3lg可以對sdc的水平產生重要影響，sdc是一種對癌症免疫反應和抗pd-1免疫治療反應非常重要的細胞類型。

4、淋巴細胞是腫瘤微環境中FLT3L的主要來源

腫瘤中FLT3LG表達與SDC水平的相關性，引出了哪個細胞類型產生FLT3L的問題。因此，我們在內源性小鼠Flt3l位點下游引入可誘導的編碼Cre和teal熒光蛋白(TFP)的DNA，從而獲得了Flt3l-報告小鼠(Fig. 2a)。攜帶與此等位基因純合的異位B16F10腫瘤的小鼠，儘管血清總FLT3L有少量但可重複的下降，但其在TME中的常規DC和淋巴細胞比例相似，這表明該蛋白在腫瘤中有類似的功能(補充 Fig. 3a–c)。Flt3l-純合報告小鼠注射異常的B16F10腫瘤，在腫瘤移植後2周，TFP作為Flt3l表達的讀數，僅在淋巴細胞內檢測到(Fig. 2b,c)。在表達Flt3l的淋巴細胞中，NK細胞表達量最高，T細胞表達量較低，B細胞表達量不高（ Fig. 2b,c; Fig. 3e,f)）。當用抗flt3l抗體檢測細胞表面的蛋白時，這些細胞群呈陽性(圖2d)。從腫瘤、腫瘤引流淋巴結(LN)和非腫瘤引流淋巴結(LN)分離的NK細胞中，Flt3l的表達水平與TFP的表達水平相似，表明Flt3l的表達不受TME的調節(Supplementary Fig. 3d)。在其他腫瘤模型中也發現了類似的報告等位基因表達模式，包括自發產生的腫瘤模型(例如，多瘤中T抗原乳腺癌模型，其目的是表達mCherry和卵清蛋白(PyMTChOVA)；Supplementary Fig. 4a,b)。有趣的是，野生型(WT)攜帶b16f10腫瘤動物血清中FLt3L水平沒有顯著差異，表明局部產生的flt3L對sdc水平和預防癌症很重要(Supplementary Fig. 4c)。

5、腫瘤中淋巴細胞產生FLT3L對於正常的SDC水平是必須的

接下來，我們在小鼠身上進行了基因實驗，以檢測淋巴細胞及其亞群在控制TME中SDC水平中的作用。對缺乏T細胞和NK細胞的IL2RG-/-小鼠(補充圖5a)注射異常的B16F10黑色素瘤，分析腫瘤中髓系細胞和淋巴系細胞的水平。雖然來自IL2RG-/-小鼠的B16F10腫瘤的腫瘤面積與其WT對照組大致相同，但是IL2RG-/-動物腫瘤可顯著降低TME中CD 103+SDC的表達，而CD11b+DC的頻率無明顯變化(圖3a和補充圖5a)。為了檢測淋巴細胞特異性地產生FLT3L在控制SDC水平中的作用，我們將IL2RG-/-骨髓與WT或Flt3l-/-混合骨髓移植到致死性照射的Flt 31-/-受體動物體內，形成混合骨髓嵌合體(圖3b)。在腫瘤中與能產生FLT3L的淋巴細胞間隔的IL2RG-/-：WT混合骨髓嵌合體相比，其淋巴細胞室不能產生FLT3L的IL2RG-/-：Flt3l-/-，CD 103+SDC的水平降低(圖3b)。腫瘤中CD 103+SDC水平的差異並不是由於T細胞或NK細胞的整體缺失所致，而是豐富的腫瘤引流和非引流LN的IL2RG-/-：Flt3l-/-骨髓嵌合體(補充圖5b)。與IL2RG-/：WT-混合骨髓嵌合體相比，IL2RG-/：Flt3l-/-混合骨髓嵌合體的CD11b+DC無明顯減少(圖3b)；此外，在腫瘤引流和非引流皮膚LN中，居住或遷移的CD11b+DC均無缺陷，提示IL2RG-/：Flt3l-/-混合骨髓嵌合體中CD11b+DC無整體缺陷(補充圖5c)。有趣的是，在IL2RG-/：Flt3l-/-骨髓嵌合體中，腫瘤引流和非引流LN中常駐CD8+DC和遷移CD 103+DC的水平也降低，提示淋巴細胞的需求更廣泛地延伸到cDC1的產生(補充圖5c)

6、NK細胞，而不是T細胞，控制著腫瘤中SDC的丰度

為了直接檢測特定類型淋巴細胞在腫瘤中控制CD 103+SDC水平的作用，在小鼠B16F10黑色素瘤模型中，我們敲出了表達Flt3l報告基因的T細胞和NK細胞。由於重組激活基因(Rag)突變而缺乏所有T細胞的小鼠其腫瘤組織中CD103+DC水平沒有減少(圖3c和補充圖5d)。此外，通過抗體消耗CD4+或CD8+T細胞的WT小鼠也表現出正常的SDC細胞密度（數據未顯示)。為了探討NK細胞的作用，小鼠在B16F10腫瘤注射前3天開始每3天用抗NK1.1抗體治療一次，結果導致了NK細胞的大量喪失，但淋巴細胞的其他變化和腫瘤生長受限(補充圖5e)。而缺乏NK細胞的小鼠TME中CD 103+SDC的頻率降低，CD11b+DC的水平無明顯變化(圖3d)。與我們以前的發現一致，腫瘤中的T細胞刺激依賴於腫瘤內的CD 103+DC，缺乏NK細胞的小鼠腫瘤中活化的T細胞數量有減少的趨勢。(補充圖5e)。有趣的是，NK細胞的耗竭導致CD103+DC在腫瘤引流和不引流LN中的水平略有下降，但有顯著性差異(補充圖5f)，再次表明除了在腫瘤中的作用外，NK細胞在控制CD103+DC水平方面發揮了更廣泛的作用。這些結果表明，雖然T細胞和NK細胞都能在腫瘤中產生Flt 31，但T細胞的缺失對腫瘤CD103+DC水平沒有影響。而NK細胞產生Flt3l在調控腫瘤中這些保護性DC的水平中起重要作用。

7、TME中NK細胞與SDCs發生頻繁而穩定的相互作用

NK細胞是腫瘤中SDC水平所必需的主要淋巴細胞。然而，NK細胞和SDC在腫瘤中非常少見，因此我們提出這樣一個問題：NK細胞如何控制腫瘤中的SDC？與其他APC相比，SDC在TME中很少存在，並且很少與傳入的T細胞相互作用。相反，當我們對B78黑色素瘤進行活體雙光子切片成像時，我們發現NK細胞(Ncr1-GF標記P)經常與SDC密切接觸(抗X-C基序趨化因子受體1(XCR 1)的抗體標記；圖4a和補充視頻1)。對由轉染mCherry-OVA融合結構的B78親本細胞組成的B78-cherryOVA腫瘤14進行活體雙光子成像後用於PyMTChOVA小鼠品系，我們發現大約1.9%的NK細胞在Xcr1-Venus+ cDC1的5μm範圍內，而只有0.38%的MHCⅠ類限制的卵清蛋白特異性(OT-I)T細胞在Xcr1-Venus+ cDC1的5μm範圍內(圖4b)。此外，我們還觀察到，在XCR 1+cDC 1中，大於5μm的NK細胞遷移(與實質性位移相關的運動)，而與之密切接觸的NK細胞(<5μm)的運動能力降低，與連續和/或突觸接觸一致(圖4c和補充視頻2)。這些結果表明，在腫瘤中，NK細胞是FLT3L的最相關來源，FLT3L控制著SDC水平，這可能是由於NK細胞對cDC1 DC親和力增強所致。這一發現與最近在TME 中NK細胞和XCR 1+DC的趨化因子受體配對的研究結果是一致的。與NK細胞直接作用於DC的情況一致，當從WT小鼠LNS中分選CD 103+DC並與NK細胞共培養時，CD103+DC 24h和72h的存活率顯著提高(圖4d)。這些研究表明，NK細胞比T細胞更能與腫瘤中的SDC形成穩定的相互作用，靶向NK細胞水平可增加FLT3L的產生，進而提高腫瘤中SDC的水平或生存期可能是一種新的治療手段。應該注意，雖然我們看到有證據表明NK細胞為CD 103+DC在腫瘤中提供了更高的存活率，但NK細胞也可能作用於DC前體以控制這些SDC。

8、人腫瘤中NK細胞丰度與FLT3LG表達及BDCA-3+ SDCs相關

我們的小鼠研究表明，NK細胞產生FLT3L，並控制腫瘤中SDC的水平。根據這些發現，我們通過基於先前發表的數據集和NK細胞特異性基因的表達譜生成NK細胞基因特徵來調查人類數據集中NK細胞的丰度(圖5a和補充圖6)。用NK細胞基因標記對TCGA黑色素瘤樣本中NK細胞丰度的估計，我們發現腫瘤中NK細胞的水平與FLT3LG的表達(圖5b)有明顯的相關性，這與腫瘤內NK細胞是FLT3LG的來源是一致的。與NK細胞基因標籤結果一致(圖5b)，天然細胞毒性觸發受體1的表達(NCR 1)、NK細胞上NK細胞受體基因的特異性表達(補充圖6)與FLT3LG在腫瘤中的表達存在顯著的個體相關性(補充圖7a)。因此，利用SDC(Fig1a)和NK細胞(Fig5a)的基因標記來估計細胞丰度，我們發現黑色素瘤(Fig5c)患者的NK細胞和SDC水平之間存在顯著的相關性，這與我們的小鼠數據一致。此外，NCR1、a NK-specific gene的表達與sdc信號有顯著的個體相關性。為了直接比較SDC和NK細胞的數量，收集人黑色素瘤活檢標本，消化成單細胞懸液，用流式細胞術進行分析(隊列A；補充圖2和補充表2)。直接分析腫瘤中的NK細胞和SDC，發現腫瘤中NK細胞水平與BDCA-3+DC水平顯著相關(圖5d)。腫瘤中的BDCA-3+DC與腫瘤中CD4+T輔助細胞(TH)、CD8+T細胞或CD 45-細胞水平無關(補充圖7c-e)，提示NK細胞與BDCA-3+DC之間存在特異性的相關性。NK細胞與BDCA-3+DC之間的相關性在其他癌症類型的TME中也被發現，尤其是在頭頸部鱗狀細胞癌中(HNSCC；圖5e)，這表明這種先天免疫細胞關係可能比單一的適應症或亞適應症更廣泛。

9、人類黑色素瘤中的NK細胞與整體存活率的提高相關

SDC與NK細胞呈正相關，從邏輯上預測NK細胞數量也能預測生存期。 每個患者中歸一化為z評分，根據中位數劃分(50%嚴格度)，NK細胞基因標籤(圖5A)用於將患者分為NK細胞數「低」或「高」。 這表明，在兩個獨立數據集的Kaplan-Meier圖分析中，NK細胞數高的患者OS顯著增加（圖6A和補充圖 7F)。 在TCGA黑色素瘤數據集中，NCR 1的表達與OS的增加顯著相關；此外，NK細胞特徵中的5個基因中有4個單獨與OS的增加有關（圖6b）。 這些發現表明，正如我們在小鼠模型中所顯示的那樣，在黑色素瘤患者中NK細胞產生FLT3LG，控制腫瘤中BDCA-3+刺激性DC水平，並導致患者生存期增加。 我們注意到這些發現並不排除NK細胞在腫瘤排斥反應中的一個更傳統的作用，即直接腫瘤細胞溶解。

10、NK細胞預測黑色素瘤患者對抗PD-1免疫治療的反應

鑒於NK細胞產生FLT3LG和控制腫瘤中SDC水平，從而預測抗PD-1免疫治療反應中的重要作用，我們探討了NK細胞和/或T細胞是否與免疫治療反應有關。 我們發現抗PD-1免疫治療的反應性與T調節(Treg)細胞、CD4+Th細胞、CD8+T細胞和PD-1+CTLA-4+T細胞無明顯相關性(Fig. 6c)，儘管其中一些群體的趨勢較弱。 特別是，我們沒有重述以前的數據，表明PD-1+CTLA-4+CD8+「耗盡」的T細胞特徵可以預測預後。 然而，NK細胞在抗PD-1免疫治療後的腫瘤中明顯增多(Fig. 6c)。 這些發現與我們在小鼠中的發現一致，即NK細胞、FLT3L和SDC形成了一組影響預後的決定因素，至少在一定程度上可能是由NK通過產生FLT3L而增強SDC所驅動的。

11、NK-SDC軸與抗PD-1免疫治療的反應性相關

用於黑色素瘤群組A的綜合流式細胞儀板對TME中的33個免疫群體進行定量(補充圖2和補充表2)。 為了確定TME中的NK細胞和SDC水平是否與抗PD-1免疫治療的反應性唯一相關，我們在每個樣本中對人群分數進行了z評分，發現在TME中已鑒定的免疫細胞中，BDCA-3+DC和NK細胞與抗PD-1免疫治療的反應性顯著相關(圖6E和補充表3)。 此外，從這個角度來看，很高頻率的HLA-DR-CD4+T細胞似乎與抗PD-1反應密切相關，並可能代表BDCA-3+DC和NK細胞數量不多的患者的另一種預後特徵。 這可能表明PD-1阻斷可被多種類型的免疫浸潤所支持，儘管還需要進一步的研究來證實。

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