WB實驗中，膜的選擇你不可不知的那些事兒...
western blot實驗，是很多童鞋心頭的一抹淡淡的憂桑；
這個實驗真的太容易做砸了，
你需要投入繁瑣的步驟和大量時間精力，
結果最好的話，也僅僅只是CV>35%的半定量結果......
今天，學霸姐姐來說說WB實驗中膜的選擇，
這也是WB實驗中非常關鍵的一步。
童鞋們應該知道，Western blot實驗中一般可以選擇硝酸纖維素膜(NC) 和PVDF膜兩種膜
那麼，NC膜和PVDF膜有什麼區別呢?
怎樣才能選擇最恰當的雜交膜進行Western blot實驗呢?
別急，一起來看——
一，NC膜、PVDF膜、尼龍膜的特點
尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型;
硝酸纖維素膜(NC膜)是目前應用最廣的一種固相支持物，價格最便宜;
而PVDF膜介於二者之間。
就結合能力而言：
尼龍膜結合DNA和RNA能力可達480-600μg/cm2，可結合短至10bp的核酸片段;
硝酸纖維素膜(NC膜)結合DNA和RNA能力可達80-100μg/cm2，對於200bp的核酸片段結合能力不強;
PVDF膜結合DNA和RNA能力可達125-300μg/cm2。
就溫度適應性而言：
尼龍膜經烘烤或紫外線照射後，核酸中的部分嘧啶鹼基可與膜上的正電荷結合;硝酸纖維素膜(NC膜)依靠疏水性相互作用結合DNA，結合不牢固;
PVDF膜結合牢固，耐高溫，特別適合於蛋白印跡。
就韌性而言：
尼龍膜較強;硝酸纖維素膜較脆，易破碎;
PVDF膜較強。
就重複性而言：
尼龍膜可反覆用於分子雜交，雜交後，探針分子可經鹼變性被洗脫下來;
硝酸纖維素膜(NC膜)不能重複使用;
PVDF膜可以重複使用。
二、WB實驗中NC膜和PVDF膜怎麼選?
NC膜
硝酸纖維素膜(NC膜)是蛋白印跡實驗的標準固相支持物。
在低離子轉移緩衝液的環境下，大多數帶負電荷的蛋白質會與硝酸纖維素膜發生疏水作用而高親和力的結合在一起，雖然這其中的機制還不是十分清楚，但由於硝酸纖維素膜(NC膜)的這個特性，而且易於封閉非特異性結合，從而得到了廣泛的應用。
在非離子型的去污劑作用下，結合的蛋白還可以被洗脫下來。根據被轉移的蛋白分子量大小，要選擇不同孔徑的硝酸纖維素膜(NC膜)。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結合就越牢固。
但是膜孔徑如果小於0.1mm，蛋白的轉移就很難進行了。
從膜的質地上來看，最重要的指標就是單位面積上能夠結合的蛋白的量。
硝酸纖維素膜(NC膜)的結合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關，市場上有些硝酸纖維素膜(NC膜)通常會還有大量的醋酸纖維素，因而降低了蛋白的結合量。
如果採用的是100%純度的硝酸纖維素，保證了最大的蛋白結合量，可達80-150μg/cm2。由於100%的純度，因而也大大減少了非特異性的結合，降低雜交背景，無需高嚴謹度的洗脫步驟。
其次，膜的強度和韌性也是需要考慮的因素。常規的硝酸纖維素膜比較脆，漂洗一兩次就會破損，不能反覆使用。
PVDF轉移膜
PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride)是蛋白質印跡法中常用的一種固相支持物。
PVDF本質是一種疏水性的聚合物，在水溶液中不會浸濕，為了在水性緩衝液和系統中使用PVDF膜，首先必須將其浸泡在50%(v/v)或更高濃度的醇溶液中。
PVDF膜在使用時需預處理，用甲醇處理的目的是活化膜上的正電基團，使其更容易與帶負電的蛋白結合。)甲醇、乙醇和異丙醇都適合浸泡這種膜。隨著膜的外觀從不透明到半透明，完全浸濕是顯而易見的。之後必須用水反覆沖洗以去除醇類，經預處理的膜可以直接放入轉印緩衝液中平衡。
一旦膜被浸濕，蛋白結合可通過蛋白與膜的接觸而實現。由於蛋白與膜的結合貫穿整個膜的厚度(深度)，結合能力是由孔的內部表面積來決定的，隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量的蛋白結合就越牢固。
0.2um PVDF膜內部表面積大約是0.45um PVDF 膜的三倍，使其吸附能力更高。
PVDF膜是疏水性的，一般大於20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小於20kD的蛋白就要用0.2μm的膜。
分析到這裡，
至於到底選哪種膜大家應該清楚了吧！
最後——WB實驗怎樣才能更快更好更省錢的完成呢?
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從此，老闆再也不用擔心我的Western Blot了，So easy !!
有了這款神器!媽媽再也不用擔心我畢不了業了!
各位同學們，我只能幫你到這裡了，
至於能不能做好WB實驗安全畢業，就靠你們自己了......
生物女學霸，一個自稱學霸其實很渣的生物汪，
努力將有趣的、有用的、有血有肉的科研那些事兒呈現給大家，關注一個好不啦~
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