抗体检测的方法学设计和单克隆抗体筛选试剂盒研发

抗体的免疫检测，在疫苗效果监测、抗体药物临床、疫苗片段研究、佐剂研究、抗体制备与筛选、免疫原性研究等领域，应用越来越广泛，要求越来越多样，基于抗原抗体免疫学检测的方式也越来越丰富。常见的有以下一些方法：

一、间接法

1、包被抗原的间接法

（1）实验原理：包被抗原，加入样本，再加入标记二抗，形成固相抗原-抗体-标记二抗免疫复合物。

（2）优点：A、可以检测抗体亚型，利用不同的二抗类型，可以检测抗体的亚型，单抗的亚型测定就是采用这个模式。B、方法简单，开发容易。

（3）缺点：A、假阳性高，特别是抗原纯度不高时，极容易产生假阳性。B、抗原用于微孔板包被，有部分位点，会被掩盖。

（4）成品试剂盒参考：IDEXX的猪蓝耳病抗体检测试剂盒。

2、包被抗体的间接法

（1）实验原理：包被二抗，加入样本，再加入标记抗原，形成固相二抗-抗体-标记抗原免疫复合物。这个方法跟包被抗原的间接法相似，有稍微的区别。

（2）优点：A、可以检测抗体亚型，利用不同的二抗类型，可以检测抗体的亚型。B、方法简单，开发容易。C、节约抗原，抗原进行标记，抗原用量只要包被的1/10，对昂贵的抗原有意义。

（3）缺点：A、假阳性高，特别是抗原纯度不高时，极容易产生假阳性。B、抗原被修饰，会改变结构，目前一般采用生物素修饰，尽量降低对抗原结构的影响。

（4）成品试剂盒参考：目前还没见过这种的成品试剂盒，只在单抗筛选时有采用。

二、双抗原夹心法

1、实验原理：包被抗原，加入样本，再加入标记抗原，形成固相抗原-抗体-标记抗体的免疫复合物。

2、优点：A、利用包被抗原和标记抗原两个抗原与抗体的免疫学反应，特异性高。B、可以测定特殊表位的抗体，比如用纯的乙肝adr亚型抗原，测定adr亚型的特异性抗体。C、可以用同一个试剂盒，测定不同种属动物的抗体。

3、缺点：A、这种方法学检测的是总的抗体，包含IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等亚型，没法分型。B、容易漏检，如果抗原的表位没有设计好，容易出现漏检，在艾滋病抗体的检测中，经常用到多种抗原混合包被和混合标记，避免抗体漏检。

4、成品试剂盒参考：乙肝病毒表面抗体（HBsAb）检测试剂盒。

三、中和试剂竞争法

1、实验原理：包被抗体，加入抗原（中和试剂），再加入样本和标记抗体，中和试剂的抗原与固相抗体结合，样本中抗体再与标记抗体竞争结合抗原（中和试剂），形成固相抗体-抗原-检测抗体免疫复合物。

2、优点：A、不用纯化抗原，只要用合适的抗体制备预包被板，就可以得到很好的亲和层析包被的抗原板。B、用一个合适抗体配对，既可以检测抗原，又可以检测抗体。C、可以利用抗体配对，测定特定抗体位点。

3、缺点：A、包被抗体和检测抗体这个配对不好筛选。B、检测抗体和样本中的抗体，要有比较好的位点竞争关系。

4、成品试剂盒参考：乙肝病毒e抗体（HBeAb）检测试剂盒。

四、直接竞争法

1、实验原理：包被抗原，加入样本，再加入标记抗体，样本中的待测抗体与标记抗体，竞争结合固相抗原，形成固相抗原-标记抗体的免疫复合物。

2、优点：A、利用特定位点的抗原，和针对特定位点的标记抗体，可以检测特定位点抗体。B、操作比较简单，检测时间短。

3、缺点：A、检测的是总的抗体，包含IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等亚型，没法分型。

4、成品试剂盒参考：IDEXX的猪瘟病毒抗体检测试剂盒。

五、液相阻断法

1、实验原理：先将样本与标准抗原混匀温育，离心取上清。上清加入预包被抗体的微孔板中，再加入检测抗体，形成固相抗体-标准抗原-标记抗体的免疫复合物。如果样本中含有待测抗体，就会跟标准抗原进行反应，中和标准抗原，那么上清中的标准抗原就会减少，后面的检测值与标准抗原相比，可以计算阻断率，阻断率越高，抗体浓度就越高。

2、优点：A、可进行特定抗体的检测，比如利用O型口蹄疫的标准抗原，和针对O型口蹄疫的配对抗体，专门检测O型口蹄疫抗体。B、一个配对抗体，既可以测抗原，又可以测抗体。C、可以检测不同种属动物的抗体，比如猪、牛、羊的口蹄疫。

3、缺点：A、检测的是总的抗体，包含IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等亚型，没法分型。B、操作比较复杂。

4、成品试剂盒参考：兰兽研的口蹄疫抗体检测试剂盒。

在所有的方法学设计中，核心还是抗原与抗体的位点设计，针对抗体的检测目的，和原料获得的难易程度，通过科学设计，得到符合预期应用的试剂盒，再搭配一步法和两步法，引入生物素-亲和素系统等方式，会衍生更多种检测方法，不一一论述。我们重点讨论在单克隆抗体研发过程中，抗体筛选试剂盒的设计与应用。

在单克隆抗体研发过程中，抗原分为两种用途：免疫原和筛选原。按抗原的来源分：多肽抗原、重组蛋白抗原、天然抗原。理论上，各种类型的抗原都可以用作免疫原和筛选原，我们根据抗原表位和抗体制备要求，应用上面各种检测方法，接下来我们会推出系列数据进行详细阐述。