1.實時定量pcr引物務必要保證擴增效率，就是說每次擴增都是與理論值偏差不多的2倍擴增。所以正式實驗之前最好做引物效率測試，即以已知濃度稀釋樣品，觀察定量值是否與理論值相同。在這方面要考慮引物本身的GC含量，PCR擴增片段的GC含量。此外，還要考慮擴增位置在cDNA上是否離polyA尾太遠，造成結果不穩定。考慮RNA不同剪切方式等等~~考慮off target，當然一般的off target都是可以通過溶解曲線看出來的，設計之前別忘了blast一下~~

2.我想你說的半定量是最後定條帶亮度吧，那麼你是沒有辦法精確確定引物擴增效率的。

具體取捨要根據你的實驗目的來哦~~~

當然不同了。real-time引物短，一般100-200 bp左右，太長很浪費；普通PCR一般要在400多，太短容易和dimer分不開。具體設計要求也有差別，一般real-time引物設計都是通過軟體進行的，普通引物要求比較低。

好像沒有

沒做過半定量，一般熒光定量PCR測轉錄，都是相對定量，絕對定量需要有已知濃度的標準品。做基因合成和測轉錄引物不一樣，定量半定量應該沒區別，區別在於你是不是有標準曲線

一般來說沒啥太大區別。

我們一般選擇會選擇特異性較高的一對引物進行試驗

RT—PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經BIOG反轉錄酶的作用，從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，在DNA聚合酶作用下擴增合成目的片段。RT—PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用於檢測細胞中基因表達水平、細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。用於反轉錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT及基因特異性引物中的一種。對於短的不具有髮夾結構的真核細胞mRNA，3種都可。

一般qpcr和半定量pcr的引物是同一個。用引物先跑半定量確定一下基因的表達是上調還是下調，然後才能跑qpcr來確定基因的更準確的表達量

和半定量的引物沒有啥區別

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