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是一件發明專利。名稱是：「自溶性微針透皮貼片及其製備方法」

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申請(專利)號：CN201410301920.7

當前專利權人：中科微針(北京)科技有限公司

發明(設計)人：a高雲華;a邱玉琴

申請日：2014.06.27

摘要

本發明屬於經皮給葯技術領域中的自溶性微針，特別涉及自溶性微針透皮貼片及其製備方法。本發明通過將內源性的寡聚透明質酸和/或低分子量硫酸乙醯肝素同時作為微針基質材料和疫苗佐劑製備自溶性微針，並將疫苗負載於其中，從而獲得本發明的自溶性微針疫苗透皮貼片。本發明的自溶性微針透皮貼片可實現疫苗的有效經皮免疫，增強疫苗的體液免疫應答。並且與現有肌肉注射免疫以及其他自溶性微針經皮免疫相比，能夠顯著增強疫苗的細胞免疫應答。

說明書

[0001]技術領域

[0002]本發明屬於經皮給葯技術領域中的自溶性微針，特別涉及自溶性微針透皮貼片及其製備方法。

[0003]背景技術

[0004]目前大多數的疫苗都是採用皮下或肌肉注射的方式進行接種，存在疼痛、需專業人員操作、疫苗的葯代動力學曲線不理想、注射針的重複使用會引發傳染病的傳播等問題。因此順應性好、方便、高效、安全的新型疫苗遞送系統的研究一直是疫苗領域的熱點。經皮免疫(Transcutaneous immunization,TCI)是指局部應用疫苗抗原和(或)佐劑於皮膚表面以引起免疫反應。皮膚是疫苗免疫的一個理想部位，其中含有比肌肉、皮下組織中更豐富的抗原呈遞細胞(Antigen presenting cells,APCs)。表皮中富含的朗格罕斯細胞(Langerhans cells,LCs)及真皮中富含的樹突狀細胞(dermal dendritic cells.dDCs)，形成獨特強有力的免疫識別、應答和效應網路。但是，傳統的透皮技術僅適用於脂溶性小分子藥物，生物大分子藥物的經皮給葯難以實現。因此經皮免疫的關鍵之處在於如何將足夠量的疫苗抗原和佐劑透過角質層傳遞至皮膚中的免疫細胞。

[0005]基於BioMEMS技術開發的微針陣列經皮給葯技術是藥物釋放領域的重大技術突破，它結合了注射和經皮給葯兩大優勢，為經皮免疫提供了新的可能性。微針(Microneedles)長度小於1mm，其穿刺皮膚可產生微米級藥物運送通道，允許大分子通過。控制微針的高度可使其穿刺深度不接觸到神經末梢，無痛無血就可使生物大分子實現皮內釋放。自溶性微針(self-dissolving microneedles)是近幾年來出現的一種新型微針。其採用可溶於水的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)等高分子材料作為微針的基質，藥物分散在基質中，微針刺入皮膚後可溶解於皮膚組織液中，從而被機體吸收。與早期的硅或金屬微針相比，自溶性微針應用於皮膚後能夠溶解於其中，無需後續的處置和回收過程，而且降低了材料和工藝的成本。另外，由於採用醫用材料，使最終獲得葯監部門批准的可能性大大增加。因此，自溶性微針已成為當今微針技術的發展趨勢。

[0006]目前，研究表明微針介導的疫苗經皮免疫傾向於誘導更強的輔助性T細胞2(Th2)型體液免疫應答，對許多疾病而言，輔助性T細胞1(Th1)型的細胞免疫應答也是必須的(J.Control.Release，2010，147：326–332；Plos One,2009,4:47-73)。因此需要選擇合適的佐劑來提高經皮免疫所誘導的細胞免疫反應應答，實現體液免疫反應和細胞免疫反應的平衡。目前自溶性微針普遍採用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、聚乙烯醇(PVA)等作為基質，其本身不具備佐劑的作用，佐劑的添加來自其他外源性材料。額外添加的佐劑會帶來成本增加以及微針的成型性和機械強度變差的問題。此外，目前常用的佐劑包括鋁佐劑、脂質體、弗氏佐劑、粘膜免疫佐劑、CpG序列、細胞因子以及納米粒子佐劑，但是上市的人用疫苗佐劑經美國FDA批准的只有鋁佐劑。鋁佐劑主要誘導體液免疫應答，而細胞免疫很弱，無法解決經皮免疫中細胞免疫弱的問題。新型疫苗遞送系統的研究開發致力於解決上述問題，達到有效、安全、穩定、經濟的目的。

[0007]危險信號模式理論為我們提供了全新的視野。Polly Matzinger於1994年提出危險信號模式理論，在該模式中，免疫系統的功能是參與識別危險信號分子與非危險信號分子。細胞損傷釋放的危險信號分子可以激活APC進而有效的激活T/B細胞產生相應的免疫應答。內源性危險信號具有交叉遞呈抗原，誘導細胞免疫的特性，提示內源性危險信號可作為疫苗佐劑誘導特異性的細胞免疫應答。

[0008]KA Scheibner等發現高分子量透明質酸的降解片段即低分子量透明質酸是一個內源性危險信號(the Journal of Immunology,2006,177:1272-1281)。當機體組織受損，高分子量透明質酸(分子量200萬～600萬)在氧自由基以及酶的作用下解聚為低分子量透明質酸(分子量20萬)。低分子量透明質酸與TLR-2作用後，以依賴於MyD88/IL-1R相關激酶、TNFR相關因子-6、蛋白激酶Cζ、NF-κB的方式進行信號傳導，激活機體的天然免疫應答；高分子量透明質酸則抑制TLR-2的信號傳導。透明質酸是細胞外基質的重要成分，它是構成皮膚、玻璃體關節滑液和軟骨組織的重要成分，具有獨特的理化性質和生物學功能。透明質酸中的重複二糖單元在所有物種和組織中都是一致的，因此不導致透明質酸分子自身的免疫排斥。低分子量透明質酸(分子量&<100萬)是透明質酸的降解產物，具有完整的透明質酸結構，生物活性高，無毒副作用，目前主要在各類化妝品中用於保濕、抗衰老、曬後修復等。研究結果表明，寡聚透明質酸(分子量&<10,000)能夠明顯增強滅活HAV抗原的免疫應答，具有強的免疫佐劑作用，其免疫佐劑效應優於鋁佐劑(細胞與分子免疫學雜誌，2008，24:183-185)。

[0009]Geoffrey BJ等發現(the Journal of Immunology,2002,168:5233-5239)，可溶性硫酸肝素利用TLR4激活樹突狀細胞。硫酸肝素是一種酸性多糖，位於細胞膜和細胞外基質。硫酸肝素的降解產物，即低分子量硫酸肝素，能夠活化樹突狀細胞。目前，低分子量硫酸乙醯肝素被認為是一種新型抗血栓和抗腫瘤轉移藥物，具有很強的抗血栓和抗腫瘤活性，調節免疫功能和調血脂、抗動脈粥樣硬化等作用，無明顯毒副作用。研究結果表明，低分子量硫酸乙醯肝素與乙肝表面抗原混合後，經鼻腔、肌肉及皮下注射3種途徑免疫小鼠，既能有效增強特異性體液免疫應答，又能顯著誘導CTL細胞免疫效應，是一種優於鋁佐劑的潛在人用疫苗佐劑(中國生物製品學雜誌，2011，24：5-9)。

[0010]發明內容

[0011]本發明的目的之一是克服現有的注射接種疫苗的缺點，提供一種適合於經皮免疫的自溶性微針疫苗透皮貼片，從而實現順應性好、方便、高效、安全的疫苗遞送。

[0012]本發明的目的之二是提供一種自溶性微針疫苗透皮貼片的製備方法。

[0013]本發明是將內源性的寡聚透明質酸和/或低分子量的硫酸乙醯肝素同時作為自溶性微針透皮貼片中的微針基質材料和疫苗佐劑，不用添加外源性佐劑來增強抗原的免疫原性，解決了現有經皮免疫技術難以誘導Th1型細胞免疫的問題。

[0014]本發明的自溶性微針透皮貼片是由微針基質材料、疫苗、疫苗佐劑和疫苗保護劑構成，其中，所述的微針基質材料和疫苗佐劑均為寡聚透明質酸、低分子量的硫酸乙醯肝素或其組合。

[0015]根據本發明的一種實施方式，其中，疫苗在所述的自溶性微針透皮貼片中所佔的百分含量為總重量的0.001％～10％，疫苗保護劑在所述的自溶性微針透皮貼片中所佔的百分含量為總重量的0.01％～30％，微針基質材料和疫苗佐劑在所述的自溶性微針透皮貼片中所佔的百分含量為總重量的60％～99.98％。優選地，疫苗在所述的自溶性微針透皮貼片中所佔的百分含量為總重量的0.01％～1％，疫苗保護劑在所述的自溶性微針透皮貼片中所佔的百分含量為總重量的0.1％～20％，微針基質材料和疫苗佐劑在所述的自溶性微針透皮貼片中所佔的百分含量為總重量的80％～99.8％。

[0016]所述的疫苗保護劑選自甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、聚糖、糊精、人血清白蛋白、明膠、精氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸鹽酸鹽、肌氨酸、L-絡氨酸、苯丙氨酸中的至少一種。優選地，所述的疫苗保護劑選自甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、聚糖、糊精中的至少一種。進一步優選地，所述的疫苗保護劑選自蔗糖、乳糖、海藻糖、聚糖、糊精中的至少一種。

[0017]本發明的自溶性微針透皮貼片中的寡聚透明質酸和/或低分子量的硫酸乙醯肝素同時作為微針基質材料和疫苗佐劑使用。與分子量較大的透明質酸和硫酸乙醯肝素相比，分子量小於10,000的寡聚透明質酸和分子量小於10,000的低分子量的硫酸乙醯肝素具有更好的佐劑作用，因此本發明中採用重均分子量在10,000以內的寡聚透明質酸和重均分子量在10,000以內的低分子量的硫酸乙醯肝素。作為微針基質材料而言，寡聚透明質酸和低分子量的硫酸乙醯肝素的重均分子量越小，製得的微針硬度越強；重均分子量越大，微針的機械強度及韌性越強。因此寡聚透明質酸和低分子量的硫酸乙醯肝素的重均分子量越小，用於刺入皮膚的微針越硬，越容易刺入皮膚，但是機械強度也隨之降低，保存及刺入皮膚時容易折斷。由此，本發明優選使用的是寡聚透明質酸的重均分子量的範圍是5000&

[0018]根據本發明的一種實施方式，所述的自溶性微針透皮貼片的規格為每平方厘米含有16～484根微針，微針的高度在150～1000微米之間，針尖的直徑在100納米～20微米之間，微針的最大截面的錐角是20～60度。優選地，所述的自溶性微針透皮貼片的規格為每平方厘米含有36～256根微針，微針的高度為300～800微米，針尖的直徑為500納米～10微米，微針的最大截面的錐角是30～50度。所述的自溶性微針透皮貼片中的每根微針的截面形狀是圓錐形或多面錐形。上述的自溶性微針透皮貼片的形狀和規格賦予其較好的機械強度，刺穿皮膚時不易斷裂。

[0019]根據本發明的一種實施方式，所述的疫苗可以選自減毒活疫苗、亞單位疫苗、多糖-蛋白質偶聯疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗中的一種。

[0020]本發明中所述的減毒活疫苗是將病原微生物(細菌或病毒)在人工訓育的條件下，促使病原微生物產生定向變異，使其極大程度地喪失致病性，但仍保留一定的剩餘毒力、免疫原性和繁衍能力。優先選自麻疹疫苗、風疹疫苗、腮腺炎疫苗、卡介苗、乙腦減毒活疫苗、手足口疫苗中的一種。

[0021]本發明中所述的亞單位疫苗是從細菌或病毒培養物中，以生物化學和物理方法提取純化有效特異性抗原製成的疫苗，或者是通過基因工程菌表達純化有效特異性抗原製成的疫苗。優先選用乙肝疫苗或流感疫苗。

[0022]本發明中所述的多糖-蛋白質偶聯疫苗是由長鏈糖分子構成，如細菌的多糖莢膜。優先選自肺炎球菌疫苗、A群流腦疫苗、A+C群流腦疫苗中的一種。

[0023]本發明中所述的DNA疫苗是將編碼某一種病原生物特異抗原的基因插入到DNA載體上，獲得的具有疫苗性質的DNA疫苗。優先選擇表達乙型肝炎表面抗原基因(S)的DNA疫苗。

[0024]本發明中所述的病毒載體疫苗是將遺傳改造的重組病毒作為載體，再從某一病原生物中獲得一段特定的基因，將獲得的一段特定的基因插入到重組病毒載體中，獲得的具有疫苗性質的重組活病毒疫苗。所述的重組活病毒疫苗優先選用痘病毒載體疫苗或腺病毒載體疫苗。所述的痘病毒載體疫苗優先選用表達乙型肝炎表面抗原基因(S)的痘病毒載體疫苗；所述的腺病毒載體疫苗優先選用表達乙型肝炎表面抗原基因(S)的腺病毒載體疫苗。

[0025]本發明的自溶性微針透皮貼片的製備方法包括以下步驟：

[0026](1)製備含有疫苗和疫苗保護劑的水溶液；

[0027](2)製備含有微針基質材料和疫苗佐劑的水溶液；

[0028](3)將步驟(1)製備的含有疫苗和疫苗保護劑的水溶液澆注到含有微孔陣列的模具上；使步驟(1)製備的含有疫苗和疫苗保護劑的水溶液填充到模具上的微孔中；乾燥澆注的含有疫苗和疫苗保護劑的水溶液；

[0029](4)將步驟(2)製備的含有微針基質材料和疫苗佐劑的水溶液澆注到步驟(3)乾燥後的模具上；使步驟(2)製備的含有微針基質材料和疫苗佐劑的水溶液填充到含有疫苗和疫苗保護劑的水溶液乾燥後塌陷出的微孔中；乾燥澆注的含有微針基質材料和疫苗佐劑的水溶液，在含有微孔陣列的模具中得到自溶性微針透皮貼片；從所述的模具上剝離乾燥後的自溶性微針透皮貼片。

[0030]所述的含有微孔陣列的模具是由聚二甲基硅氧烷製備而成的板，其每平方厘米表面含有16～484個微孔陣列(優選地，每平方厘米表面含有36～256個微孔陣列)，微孔的高度在150～1000微米之間(優選地，微孔的高度為300～800微米)，孔尖的直徑在100納米～20微米之間(優選地，孔尖的直徑為500納米～10微米)，微孔的最大截面的錐角是20～60度(優選地，微孔的最大截面的錐角是30～50度)。

[0031]所述的每個微孔的截面形狀是圓錐形或多面錐形。

[0032]所述的步驟(3)和步驟(4)可以通過離心力或壓力實施。

[0033]所述的含有疫苗和疫苗保護劑的水溶液的配製及使用，是按照得到的疫苗在所述的自溶性微針透皮貼片中所佔的百分含量為總重量的0.001％～10％，疫苗保護劑在所述的自溶性微針透皮貼片中所佔的百分含量為總重量的0.01％～30％進行配製及使用(優選地，是按照得到的疫苗在所述的自溶性微針透皮貼片中所佔的百分含量為總重量的0.01％～1％，疫苗保護劑在所述的自溶性微針透皮貼片中所佔的百分含量為總重量的0.1％～20％進行配製及使用)。

[0034]所述的含有微針基質材料和疫苗佐劑的水溶液的配製及使用，是按照得到的微針基質材料和疫苗佐劑在所述的自溶性微針透皮貼片中所佔的百分含量為總重量的60％～99.98％進行配製及使用(優選地，是按照得到的微針基質材料和疫苗佐劑在所述的自溶性微針透皮貼片中所佔的百分含量為總重量的80％～99.8％進行配製及使用)。

[0035]本發明通過將內源性的寡聚透明質酸和/或低分子量硫酸乙醯肝素同時作為微針基質材料和疫苗佐劑製備自溶性微針，並將疫苗負載於其中，從而獲得本發明的自溶性微針疫苗透皮貼片。本發明的自溶性微針透皮貼片可實現疫苗的有效經皮免疫，增強疫苗的體液免疫應答。並且與現有肌肉注射免疫以及其他自溶性微針經皮免疫相比，能夠顯著增強疫苗的細胞免疫應答。本發明與現有技術相比具有如下優點和效果：1)與注射免疫相比，微針作用於皮膚無痛感，不會留下感染點，可自行接種，無需專業人員操作；2)寡聚透明質酸和/或低分子量硫酸乙醯肝素作為基質材料的同時又作為佐劑，避免了佐劑的額外添加帶來的成本增加以及微針的成型性和機械強度變差的問題；3)寡聚透明質酸和/或低分子量硫酸乙醯肝素是內源性物質，在免疫劑量範圍內是安全可靠的；4)寡聚透明質酸和/或低分子量硫酸乙醯肝素作為疫苗佐劑，不僅能誘導抗原特異性的體液免疫應答，而且能誘導細胞免疫應答，明顯優於鋁佐劑。

[0036]附圖說明

[0037]圖1.本發明實施例1的三稜錐形自溶性微針。

[0038]圖2.本發明實施例2的圓錐形自溶性微針。

[0039]圖3.本發明實施例4的自溶性微針硬度測試。

[0040]圖4.本發明實施例5的負載乙肝表面抗原的寡聚透明質酸微針經皮免疫誘導的血清抗-HBs IgG水平。

[0041]圖5.本發明實施例6的負載乙肝DNA疫苗VR-S2S的低分子量的硫酸乙醯肝素微針經皮免疫誘導的血清抗-HBs IgG水平。

[0042]圖6.本發明實施例7的負載重組腺病毒載體乙肝疫苗rMVA-E4的寡聚透明質酸/低分子量的硫酸乙醯肝素微針經皮免疫誘導的血清抗-HBs IgG水平。

[0043]具體實施方式

[0044]以下結合具體實施例對本發明作進一步的說明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而非限制本發明的保護範圍。實施例中採用的實施條件可以根據具體要求作進一步的調整，未註明的實施條件通常為常規實驗中的條件。實施例1製作以乙肝表面抗原HBsAg為代表的亞單位疫苗自溶性微針透皮貼片

[0045](1)模具的製備：依託表面有36個(6×6行)高約650微米的微針，微針的最大截面的錐角為35度，底座面積為0.5cm×0.5cm的四稜錐形不鏽鋼母模模具，取預聚合的聚二甲基硅氧烷10克和交聯劑1克的混合物(SYLGARD 184,silicone elastomer,Dowcorning)並覆蓋在母模模具上，在溫度為80℃下放置30分鐘左右，得到表面具有與所述的母模模具上微針針體的形狀和數量相適配的所需數量的針孔的模具；

[0046](2)將5毫克負載有5微克台盤蘭(使用台盤蘭是為了將目標藥物在自溶性微針中的分布可視化)的HBsAg的PBS溶液與5毫克10重量％的海藻糖溶液混合均勻，將上述混合溶液覆蓋到步驟(1)得到的表面有針孔的模具中，在封閉容器中加2個大氣壓10分鐘，使所述的溶液進入到針孔中，將上述模具放於乾燥器中，4℃條件下晾乾；

[0047](3)將寡聚透明質酸按照45重量％溶解到水中，作為基質材料製作液，然後將0.1克該基質材料製作液倒入步驟(2)乾燥後得到的負載有台盤蘭、HBsAg與海藻糖的塌陷出的針孔中，置於密閉容器中，在模具上方施加2個大氣壓，維持10分鐘，使所述的針孔中殘存的空氣溢出；然後將覆蓋有基質材料製作液的模具於乾燥器中4℃條件下晾乾，將乾燥後的自溶性微針疫苗貼片取下，得到含寡聚透明質酸的自溶性微針疫苗貼片(如圖1所示)，自溶性微針針體的高度是650微米，針尖的角度是35度；其中台盤蘭基本分布在每一根微針的針體部分，背襯層基本不含有台盤蘭。所得的自溶性微針疫苗貼片中含疫苗5微克，疫苗保護劑(海藻糖)0.5毫克，微針基質材料(寡聚透明質酸)45毫克。

[0048]本實施例中選用的寡聚透明質酸的重均分子量為5000，由山東福瑞達生物醫藥有限公司提供。本實施例中使用的乙肝表面抗原由大連漢信生物製藥有限公司提供。

[0049]實施例2製作以表達乙型肝炎表面抗原基因(S)的DNA疫苗VR-S2S為代表的DNA疫苗自溶性微針透皮貼片

[0050](1)模具的製備：依託表面有81個(9×9行)高約500微米的微針，微針的最大截面的錐角為30度，底座面積為0.5cm×0.5cm的圓錐形不鏽鋼母模模具，取預聚合的聚二甲基硅氧烷10克和交聯劑1克的混合物(SYLGARD 184,silicone elastomer,Dowcorning)並覆蓋在母模模具上，在溫度為80℃下放置30分鐘左右，得到表面具有與所述的母模模具上微針針體的形狀和數量相適配的所需數量的針孔的模具；

[0051](2)將10毫克負載有10微克台盤蘭(使用台盤蘭是為了將目標藥物在自溶性微針中的分布可視化)的VR-S2S的PBS溶液與10毫克20重量％的海藻糖溶液混合均勻，將上述溶液覆蓋到步驟(1)得到的表面有針孔的模具中，在封閉容器中加2個大氣壓10分鐘，使針體製作液進入到所述的針孔中，將上述模具放於乾燥器中，4℃條件下晾乾；

[0052](3)將低分子量的硫酸乙醯肝素按照50重量％溶解到水中，作為基質材料製作液，然後將0.02克該基質材料製作液倒入步驟(2)乾燥後得到的負載有台盤蘭、VR-S2S與海藻糖的塌陷出的針孔中，置於密閉容器中，在模具上方施加2個大氣壓，維持10分鐘，使所述的針孔中殘存的空氣溢出；然後將覆蓋有基質材料製作液的模具於乾燥器中4℃條件下晾乾，將乾燥後的自溶性微針疫苗貼片取下，得到含有低分子量硫酸乙醯肝素的自溶性微針疫苗透皮貼片(如圖2所示)，自溶性微針針體的高度是500微米，針尖的角度是30度，針尖直徑是5微米；其中台盤蘭基本分布在每一根微針的針體部分，背襯層基本不含有台盤蘭。所得的自溶性微針疫苗貼片中含疫苗10微克，疫苗保護劑(海藻糖)2毫克，微針基質材料(寡聚透明質酸)10毫克。

[0053]本實施例中選用的低分子量的硫酸乙醯肝素的重均分子量為4000，由山東福瑞達生物化工有限公司提供。本實施例中使用的表達乙型肝炎表面抗原基因(S)的DNA疫苗VR-S2S由解放軍302醫院提供。

[0054]實施例3製作以表達乙型肝炎表面抗原基因(S)的腺病毒載體疫苗rMVA-E4為代表的病毒載體疫苗自溶性微針透皮貼片

[0055](1)模具的製備：依託表面有484個(22×22行)高約300微米的微針，微針的最大截面的錐角是45度，底座面積為1cm×1cm的八稜錐形不鏽鋼母模模具，取預聚合的聚二甲基硅氧烷10克和交聯劑1克的混合物(SYLGARD 184,silicone elastomer,Dowcorning)並覆蓋在母模模具上，在溫度為80℃下放置30分鐘左右，得到表面具有與所述的母模模具上微針針體的形狀和數量相適配的所需數量的針孔的模具；

[0056](2)將20毫克負載有200微克rMVA-E4的PBS溶液與20毫克30重量％的海藻糖溶液混合均勻，將上述溶液覆蓋到步驟(1)得到的表面有針孔的模具中，在封閉容器中加2個大氣壓10分鐘，使針體製作液進入到所述的針孔中，將上述模具放於乾燥器中，4℃條件下晾乾；

[0057](3)將低分子量的硫酸乙醯肝素、寡聚透明質酸和海藻糖分別按照20重量％、20重量％，10重量％溶解到水中，作為含疫苗保護劑的基質材料製作液，然後將0.1克該製作液倒入步驟(2)得到的負載有疫苗的模具中，置於密閉容器中，在模具上方施加2個大氣壓，維持10分鐘，使所述的針孔中殘存的空氣溢出；然後將覆蓋有基質材料製作液的模具於乾燥器中4℃條件下晾乾，將乾燥後的自溶性微針疫苗貼片取下，得到含有低分子量的硫酸乙醯肝素和寡聚透明質酸的自溶性微針疫苗透皮貼片，自溶性微針針體的高度是300微米，針尖的角度是45度，針尖直徑是1微米。自溶性微針疫苗貼片中含疫苗200微克，疫苗保護劑(海藻糖)16毫克，寡聚透明質酸和低分子量的硫酸乙醯肝素各20毫克。

[0058]本實施例中選用的寡聚透明質酸的重均分子量為10,000、低分子量的硫酸乙醯肝素的重均分子量為10,000，由山東福瑞達生物化工有限公司提供。本實施例中使用表達乙型肝炎表面抗原基因(S)的腺病毒載體疫苗rMVA-E4由解放軍302醫院提供。

[0059]實施例4

[0060]微針性能的測試：使用壓力測試平台測試實施例1中製備的自溶性微針針尖可以承受的壓力。以微針經受作用力後微針針尖有輕微變化，但是仍能基本刺穿豬耳朵皮膚角質層(角質層被刺穿時，台盤蘭染色呈藍色)時微針承受的壓力作為自溶性微針針尖可以承受的最大壓力。結果如圖3所示，當壓力增大到4N時微針最尖端開始出現輕微損害，而壓力為2N時100％的針孔都被台盤蘭染色，表明只需2N的力即可刺穿皮膚，這說明該自溶性微針貼片具有較高的硬度和刺穿皮膚性能。

[0061]比較例1

[0062]按照實施例1的製作方法，把寡聚透明質酸換成PVP-k30製作乙肝表面抗原HBsAg自溶性微針透皮貼片。PVP-k30由北京國人逸康科技有限公司提供，其餘試劑與實施例1相同。

[0063]比較例2

[0064]按照實施例2的製作方法，把低分子量的硫酸乙醯肝素換成PVP-k30製作乙肝DNA疫苗VR-S2S自溶性微針透皮貼片。PVP-k30由北京國人逸康科技有限公司提供，其餘試劑與實施例2相同。

[0065]比較例3

[0066]按照實施例3的製作方法，把低分子量的硫酸乙醯肝素和寡聚透明質酸的混合物換成PVP-k30製作重組腺病毒載體乙肝疫苗rMVA-E4自溶性微針透皮貼片。PVP-k30由北京國人逸康科技有限公司提供，其餘試劑與實施例3相同。

[0067]比較例4

[0068]按照實施例1的製作方法，把寡聚透明質酸(重均分子量4000)換成高分子量透明質酸(重均分子量2×106)製作乙肝表面抗原HBsAg自溶性微針透皮貼片。透明質酸(重均分子量2×106)由山東福瑞達生物化工有限公司提供。

[0069]比較例5

[0070]按照實施例1的製作方法，把寡聚透明質酸(重均分子量4000)換成鋁佐劑，形成的微針質地疏鬆，無法刺穿皮膚。

[0071]實施例5

[0072]本實施中是通過小鼠免疫試驗來對實施例1中以寡聚透明質酸為微針基質的自溶性微針貼片、比較例1中的以PVP-k30為微針基質的自溶性微針貼片以及比較例4中的以高分子量透明質酸為微針基質的自溶性微針貼片的免疫效果進行對比。

[0073](1)免疫

[0074]BALB/c小鼠分為實施例1組、比較例1組、比較例4組、對照組、空白組，每組25隻小鼠。實施例1、比較例1組、比較例4組的小鼠處理前先用剪子將腹部毛去除，然後用手按壓的方式分別將實施例1中寡聚透明質酸為基質材料的自溶性微針貼片、比較例1中的以PVP-k30為微針基質的自溶性微針貼片以及比較例4中的以高分子量透明質酸為微針基質的自溶性微針貼片作用於小鼠腹部，3分鐘後將貼片取下。每隻小鼠用一片貼片處理，每片貼片含乙肝表面抗原為5微克；對照組肌肉注射含鋁佐劑的重組(酵母)乙型肝炎疫苗，劑量為每隻小鼠0.4毫克Al(OH)3吸附5微克乙肝表面抗原；空白組，僅注射生理鹽水，100微升/只。

[0075]免疫方案：共免疫3次，分別在0，2，4周免疫BALB/c小鼠。

[0076](2)ELISA檢測血清抗-HBs IgG水平

[0077]在初次免疫後4周，採集小鼠尾靜脈血，分離血清，ELISA檢測血清抗-HBs IgG水平，按蛋白微孔試劑盒方法進行檢測，具體方法是：40微升HBsAg溶於10毫升1×包被稀釋液，混勻，包被96孔酶標板，100微升/孔；酶標板放於濕盒，4℃過夜；倒掉孔內液體，拍凈板子；加入1×BSA，200微升/孔；酶標板在37℃濕盒放置1小時；倒掉孔內液體，拍凈板子；血清經倍比系列稀釋後，加入酶標板，100微升/孔，37℃濕盒放置1小時；用試劑盒配製的洗液洗板4次，每次5分鐘，末次拍凈酶標板；加入試劑盒配製的二抗(peroxidase結合的羊抗鼠IgG)，100微升/孔，37℃濕盒放置1小時；用洗液洗板4次，每次5分鐘，末次拍凈酶標板；加入試劑盒配製的顯色液，100微升/孔，避光顯色10～25分鐘。加終止液，每孔100微升；酶標板放入酶標儀，在405nm處讀板。

[0078](3)乳酸脫氫酶法檢測細胞毒活性

[0079]在初次免疫後6周，檢測實施例1組、比較例1組、比較例4組、對照組、空白組誘導的細胞免疫水平(CTL反應)。

[0080]A.效應細胞製備

[0081]眼球取血後，快速取出小鼠脾臟，製成細胞懸液，用含質量濃度為10％小牛血清的RPMI1640培養基調細胞濃度到107/mL。培養1天後，加入5mg/LHBsAg CTL表位、1×106U/L rmIL-2及5mg/L ConA，隔日半量換液，同時添加半量HBsAg CTL表位，rmlL-2及5mg/L ConA。第5天時，收集細胞、計數，調整細胞密度至1×106/mL，作為效應細胞。

[0082]B.靶細胞製備

[0083]取對數生長期的P815細胞(P815傳代後生長1d)，用含10mg/L HBsAgCTL表位的RPMI1640培養液培養過夜，加入絲裂黴素至25mg/L,45分鐘後收集細胞，調整細胞密度至1×104/孔，作為靶細胞。

[0084]C.CTL活性測定

[0085]採用96孔圓底塑料培養板進行，每個樣至少設3個復孔。

[0086]分組加樣：實驗組每孔加靶細胞懸液和效應細胞懸液各100微升。效應細胞與靶細胞的比率(效：靶比)取100:1；最大釋放組每孔加靶細胞懸液和1％Triton X-100水溶液各100微升。這樣可使靶細胞完全破壞，胞內LDH全部釋放；自發釋放組每孔加靶細胞懸液和培養液各100微升。

[0087]微孔塑料板經800轉/分鐘離心5分鐘。置37℃、體積濃度為5％CO2培養箱中培養5小時；取出微孔板，以2000轉/分鐘離心5分鐘。從每孔中取出50微升上清液用於CTL的殺傷活性檢測。

[0088]檢測方法用乳酸脫氫酶(LDH)法。參照CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒說明書進行。

[0089]計算方法：Cytotoxicity(％)＝(實驗釋放-效自發釋放-靶自發釋放)/(靶最大釋放-靶自發釋放)×100％

[0090]動物實驗結果如下(用SPSS軟體分析實驗結果，兩組之間差異比較採用配對t檢驗，結果採用幾何平均值±標準誤)：

[0091]在初次免疫後4周，實施例1組，比較例1組，比較例4組、對照組的Iog10IgG水平分別為3.86±0.35，3.21±0.24，2.80±0.12，3.30±0.19；而空白組誘導的抗HBs IgG水平則很低，接近於0(見圖4)。在以上各個時間點，實施例1組、比較例1組、比較例4組和對照組誘導的抗-HBs IgG水平均顯著高於空白組(P&<0.01)，實施例1組誘導的抗-HBs IgG水平顯著高於比較例1組、比較例4組和對照組(P&<0.05)，比較例1組和對照組誘導的抗-HBs IgG水平則無顯著性差異(P&>0.05)，比較例1組誘導的抗-HBs IgG水平顯著高於比較例4組。說明PVP-k30為基質製備的自溶性微針貼片經皮免疫能夠達到含鋁佐劑乙肝疫苗肌肉注射的免疫效果，寡聚透明質酸為基質材料製備的自溶性微針的免疫效果優於PVP-k30為基質材料製備的自溶性微針貼片經皮免疫和含鋁佐劑乙肝疫苗肌肉注射，提示寡聚透明質酸起到了基質和佐劑的雙重作用。與此同時，PVP-k30為基質製備的自溶性微針貼片的免疫效果優於以高分子量透明質酸為基質製備的自溶性微針貼片經皮免疫，表明高分子量透明質酸對免疫應答可能有一定的抑制作用。

[0092]在初次免疫後6周，實施例1組誘導的CTL活性顯著高於比較例1組、比較例4組、對照組和空白組(P&<0.01)，而比較例1組、比較例4組、對照組誘導的CTL活性與空白組無顯著差異(P&>0.05)，見表1。研究結果說明，寡聚透明質酸能夠顯著增強自溶性微針中乙肝表面抗原的細胞免疫應答，顯著優於PVP-k30和鋁佐劑。

[0093]表1寡聚透明質酸與乙肝表面抗原免疫誘導的CTL活性(％)

[0094]

實施例1組比較例1組比較例4組對照組空白組51.2±13.46.2±1.37.8±1.39.5±1.65.8±0.7

[0095]實施例6

[0096]本實施例中是通過小鼠免疫試驗來對實施例2中以低分子量硫酸乙醯肝素為基質材料的自溶性微針貼片和比較例2中以PVP-k30為基質材料的自溶性微針貼片的免疫效果進行對比。

[0097](1)免疫

[0098]BALB/c小鼠分為實施例2組，比較例2組，對照組、空白組，每組25隻。實施例2組和比較例2組的小鼠處理前先用剪子將腹部毛去除，然後用手壓的方式分別將實施例2中以低分子量硫酸乙醯肝素為基質材料的自溶性微針貼片和比較例2中以PVP-k30為基質材料的自溶性微針貼片作用於小鼠腹部，3分鐘後將貼片取下。每隻小鼠用一片貼片處理，每片貼片含VR-S2S為10微克；對照組肌肉注射VR-S2S，劑量為每隻小鼠10微克VR-S2S；空白組，僅注射生理鹽水，100微升/只。

[0099]免疫方案：共免疫3次，分別在0,2,4周免疫BALB/c小鼠。

[0100](2)ELISA檢測血清抗-HBs IgG水平

[0101]在初次免疫後4周，採集小鼠尾靜脈血，分離血清，ELISA檢測血清抗-HBs IgG水平，按蛋白微孔試劑盒方法進行檢測，具體方法是：40微升HBsAg溶於10毫升1×包被稀釋液，混勻，包被96孔酶標板，100微升/孔；酶標板放於濕盒，4℃過夜；倒掉孔內液體，拍凈板子；加入1×BSA，200微升/孔；酶標板在37℃濕盒放置1小時；倒掉孔內液體，拍凈板子；血清經倍比系列稀釋後，加入酶標板，100微升/孔，37℃濕盒放置1小時；用試劑盒配製的洗液洗板4次，每次5分鐘，末次拍凈酶標板；加入試劑盒配製的二抗(peroxidase結合的羊抗鼠IgG)，100微升/孔，37℃濕盒放置1小時；用洗液洗板4次，每次5分鐘，末次拍凈酶標板；加入試劑盒配製的顯色液，100微升/孔，避光顯色10～25分鐘。加終止液，每孔100微升；酶標板放入酶標儀，在405nm處讀板。

[0102](3)乳酸脫氫酶法檢測細胞毒活性

[0103]在初次免疫後6周，檢測實施例2組、比較例2組、對照組、空白組誘導的細胞免疫水平(CTL反應)。

[0104]A.效應細胞製備

[0105]眼球取血後，快速取出小鼠脾臟，製成細胞懸液，用含質量濃度為10％小牛血清的RPMI1640培養基調細胞濃度到107/mL。培養1天後，加入5mg/LHBsAg CTL表位、1×106U/L rmIL-2及5mg/L ConA，隔日半量換液，同時添加半量HBsAg CTL表位，rmlL-2及5mg/L ConA。第5天時，收集細胞、計數，調整細胞密度至1×106/mL，作為效應細胞。

[0106]B.靶細胞製備

[0107]取對數生長期的P815細胞(P815傳代後生長1d)，用含10mg/L HBsAgCTL表位的RPMI1640培養液培養過夜，加入絲裂黴素至25mg/L，45分鐘後收集細胞，調整細胞密度至1×104/孔，作為靶細胞。

[0108]C.CTL活性測定

[0109]採用96孔圓底塑料培養板進行，每個樣至少設3個復孔。

[0110]分組加樣：實驗組每孔加靶細胞懸液和效應細胞懸液各100微升。效應細胞與靶細胞的比率(效：靶比)取100:1；最大釋放組每孔加靶細胞懸液和1％Triton X-100水溶液各100微升。這樣可使靶細胞完全破壞，胞內LDH全部釋放；自發釋放組每孔加靶細胞懸液和培養液各100微升。

[0111]微孔塑料板經800轉/分鐘離心5分鐘。置37℃、體積濃度為5％CO2培養箱中培養5小時；取出微孔板，以2000轉/分鐘離心5分鐘。從每孔中取出50微升上清液用於CTL的殺傷活性檢測。

[0112]檢測方法用乳酸脫氫酶(LDH)法。參照CytoTox96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒說明書進行。

[0113]計算方法：Cytotoxicity(％)＝(實驗釋放-效自發釋放-靶自發釋放)/(靶最大釋放-靶自發釋放)×100％

[0114]動物實驗結果如下(用SPSS軟體分析實驗結果，兩組之間差異比較採用配對t檢驗，結果採用幾何平均值±標準誤)：

[0115]在初次免疫後4周，實施例2組，比較例2組，對照組的Iog10IgG水平分別為3.24±0.16，2.63±0.11，2.72±0.12；而空白組誘導的抗HBs IgG水平則很低，接近於0(見圖5)。在以上各個時間點，實施例2組、比較例2組和對照組誘導的抗-HBs IgG水平均顯著高於空白組(P&<0.01)，實施例2組誘導的抗-HBs IgG水平顯著高於比較例2組和對照組(P&<0.05)，而比較例2組和對照組誘導的抗-HBs IgG水平則無顯著性差異(P&>0.05)。說明低分子量的硫酸乙醯肝素為基質材料製備的自溶性微針的免疫效果優於PVP-k30為基質材料製備的自溶性微針貼片經皮免疫和肌肉注射免疫。提示低分子量的硫酸乙醯肝素起到了基質材料和佐劑的雙重作用。

[0116]在初次免疫後6周，實施例2組誘導的CTL活性顯著高於比較例2組、對照組和空白組(P&<0.01)，而比較例2組、對照組誘導的CTL活性與空白組無顯著差異(P&>0.05)，見表2。研究結果說明，低分子量的硫酸乙醯肝素能夠顯著增強自溶性微針中乙肝DNA疫苗的細胞免疫應答，顯著優於PVP-k30為基質材料的自溶性微針經皮免疫和肌肉注射免疫。

[0117]表2乙肝DNA疫苗免疫誘導的CTL活性(％)

[0118]

實施例2組比較例2組對照組空白組40.6±9.67.1±1.87.4±2.36.0±1.7

[0119]實施例7

[0120]本實施例中是通過小鼠免疫試驗來對實施例3中以寡聚透明質酸和低分子量硫酸乙醯肝素為基質材料的自溶性微針貼片和比較例3中的以PVP-k30為基質材料的自溶性微針貼片的免疫效果進行對比。

[0121](1)免疫

[0122]BALB/c小鼠分為實施例3組，比較例3組，對照組、空白組，每組25隻。實施例3組和比較例3組的小鼠處理前先用剪子將腹部毛去除，然後用手壓的方式分別將實施例3中以寡聚透明質酸和低分子量的硫酸乙醯肝素為基質材料的自溶性微針貼片和比較例3中的以PVP-k30為基質材料的自溶性微針貼片作用於小鼠腹部，3分鐘後將貼片取下。每隻小鼠用一片貼片處理，每片貼片含rMVA-E4為20微克；對照組肌肉注射rMVA-E4，劑量為每隻小鼠20微克rMVA-E4；空白組，僅注射生理鹽水，100微升/只。

[0123]免疫方案：共免疫3次，分別在0,2,4周免疫BALB/c小鼠。

[0124](2)ELISA檢測血清抗-HBs IgG水平

[0125]在初次免疫後4周，採集小鼠尾靜脈血，分離血清，ELISA檢測血清抗-HBs IgG水平，按蛋白微孔試劑盒方法進行檢測，具體方法是：40微升HBsAg溶於10毫升1×包被稀釋液，混勻，包被96孔酶標板，100微升/孔；酶標板放於濕盒，4℃過夜；倒掉孔內液體，拍凈板子；加入1×BSA，200微升/孔；酶標板在37℃濕盒放置1小時；倒掉孔內液體，拍凈板子；血清經倍比系列稀釋後，加入酶標板，100微升/孔，37℃濕盒放置1小時；用試劑盒配製的洗液洗板4次，每次5分鐘，末次拍凈酶標板；加入試劑盒配製的二抗(peroxidase結合的羊抗鼠IgG)，100微升/孔，37℃濕盒放置1小時；用洗液洗板4次，每次5分鐘，末次拍凈酶標板；加入試劑盒配製的顯色液，100微升/孔，避光顯色10～25分鐘。加終止液，每孔100微升；酶標板放入酶標儀，在405nm處讀板。

[0126](3)乳酸脫氫酶法檢測細胞毒活性

[0127]在初次免疫後6周，檢測實施例3組、比較例3組、對照組、空白組誘導的細胞免疫水平(CTL反應)。

[0128]A.效應細胞製備

[0129]眼球取血後，快速取出小鼠脾臟，製成細胞懸液，用含質量濃度為10％小牛血清的RPMI1640培養基調細胞濃度到107/mL。培養1天後，加入5mg/LHBsAg CTL表位、1×106U/L rmIL-2及5mg/L ConA，隔日半量換液，同時添加半量HBsAg CTL表位，rmlL-2及5mg/L ConA。第5天時，收集細胞、計數，調整細胞密度至1×106/mL，作為效應細胞。

[0130]B.靶細胞製備

[0131]取對數生長期的P815細胞(P815傳代後生長1d)，用含10mg/L HBsAgCTL表位的RPMI1640培養液培養過夜，加入絲裂黴素至25mg/L，45分鐘後收集細胞，調整細胞密度至1×104/孔，作為靶細胞。

[0132]C.CTL活性測定

[0133]採用96孔圓底塑料培養板進行，每個樣至少設3個復孔。

[0134]分組加樣：實驗組每孔加靶細胞懸液和效應細胞懸液各100微升。效應細胞與靶細胞的比率(效：靶比)取100:1；最大釋放組每孔加靶細胞懸液和1％Triton X-100水溶液各100微升。這樣可使靶細胞完全破壞，胞內LDH全部釋放；自發釋放組每孔加靶細胞懸液和培養液各100微升。

[0135]微孔塑料板經800轉/分鐘離心5分鐘。置37℃、體積濃度為5％CO2培養箱中培養5小時；取出微孔板，以2000轉/分鐘離心5分鐘。從每孔中取出50微升上清液用於CTL的殺傷活性檢測。

[0136]檢測方法用乳酸脫氫酶(LDH)法。參照CytoTox96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒說明書進行。

[0137]計算方法：Cytotoxicity(％)＝(實驗釋放-效自發釋放-靶自發釋放)/(靶最大釋放-靶自發釋放)×100％

[0138]動物實驗結果如下(用SPSS軟體分析實驗結果，兩組之間差異比較採用配對t檢驗，結果採用幾何平均值±標準誤)：

[0139]在初次免疫後4周，實施例3組，比較例3組，對照組的Iog10IgG水平分別為2.51±0.18，1.70±0.10，1.62±0.14；而空白組誘導的抗HBs IgG水平則很低，接近於0(見圖6)。在以上各個時間點，實施例3組、比較例3組和對照組誘導的抗-HBs IgG水平均顯著高於空白組(P&<0.01)，實施例3組誘導的抗-HBs IgG水平顯著高於比較例3組和對照組(P&<0.05)，而比較例3組和對照組誘導的抗-HBs IgG水平則無顯著性差異(P&>0.05)。說明寡聚透明質酸和低分子量的硫酸乙醯肝素為基質材料製備的自溶性微針的免疫效果優於PVP-k30為基質材料製備的自溶性微針貼片經皮免疫和rMVA-E4肌肉注射。提示寡聚透明質酸和低分子量的硫酸乙醯肝素起到了基質材料和佐劑的雙重作用。

[0140]在初次免疫後6周，實施例3組誘導的CTL活性顯著高於比較例2組、對照組和空白組(P&<0.01)，而比較例3組、對照組誘導的CTL活性與空白組無顯著差異(P&>0.05)，見表3。研究結果說明，寡聚透明質酸和低分子量的硫酸乙醯肝素能夠顯著增強自溶性微針中乙肝病毒載體疫苗的細胞免疫應答，顯著優於PVP-k30為基質材料的自溶性微針經皮免疫和肌肉注射免疫。

[0141]表3重組腺病毒載體乙肝疫苗免疫誘導的CTL活性(％)

[0142]

實施例3組比較例3組對照組空白組27.6±6.75.4±1.26.5±2.05.2±0.5

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發明專利

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發明專利呢。

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這不是看看清清楚楚嗎

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正確專利號寫法應該是ZL201410301920.7

其中，ZL代表已經授權，2014代表申請遞交時的年份，1代表發明（2是實用新型，3是外觀設計，8是國際pct申請進入中國的對應申請），後面是序列號和驗證位，無特定含義。

這個專利是增強疫苗的細胞免疫應答的，你如果需要，我可以把文檔下載下來發給你

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這是一份發明專利，名稱為：自溶性微針透皮貼片及其製備方法

在2018年12月18日做了轉讓轉讓給了圖中的公司

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