大腸桿菌酶切之後如果沒有成功連接質粒，大腸桿菌還能長出來麼。？環狀dna是大腸桿菌生長的必須麼？還有在37度培養的時候被實驗室其他人把培養基放到了4度冰箱，5分鐘左右。會對大腸桿菌產生損傷麼？謝謝啦。希望在給我點其他過程對應的作用。

1.沒連上點話 肯定長不出來

可能沒連上。 基本上做轉化都適合 能接受的最不環狀的質粒 就是一邊差一個磷酸二酯鍵 載體去磷酸化之後又插入了正常的目的片段的那種結果 要是真的中間差一段或者沒有磷酸二酯鍵帶著的話 估計沒啥戲……

2.4度冰箱 過夜問題都沒事 安心吧 該出來的 不差那五分鐘

3.質粒是大腸桿菌的質粒麼？ 起碼得有對應的元件吧 看看質粒說明書4.看看養24小時（amp的話建議不超過18小時）有沒有點 要是沒有的話 那就是真的沒進去5.抗生素加的對麼？ 種類和濃度…… 加錯了 加多了 都會有影響（加多了不至於那麼誇張 親測4倍推薦濃度照樣有點的）

6.你用的感受態對麼？ 熱擊的？電擊的？買的？自己做的？…… 弄個電擊的感受態整熱擊不太合適的

7.你的操作沒問題麼？是否注意全程冰上？是否輕拿輕放？有沒有暴力的吹打？熱擊（電擊）參數對麼？8.熱擊（電擊）後加的培養基裡面沒抗生素吧？！熱擊（電擊）後加的培養基裡面沒抗生素吧？！熱擊（電擊）後加的培養基裡面沒抗生素吧？！沒有吧！沒有吧！沒有吧！9.塗布的時候 沒燙死菌吧？加油！

叫你不做對照實驗！ ！

同時轉一組沒有酶切連接的完整質粒。出來了就是你酶切連接的問題，沒出來就是轉化或感受態的問題。
多養一會，有時候轉化的質粒太大或是其他原因，菌的生長會很慢，養36小時再看看，還沒有的話就重來吧
轉化後轉化子長不出來有幾種情況：1，感受態存放時間過長導致細菌活力很低。2，感受態效率太低，質粒沒有轉進感受態細胞中，使大腸桿菌在篩選平板上不能生長。3，所轉化的重組質粒對大腸桿菌生長有影響，造成生長緩慢。4，篩選平板用錯了或者抗生素加錯了（如果是抗性篩選的話）其他的還沒想到，想到再說。如果你確定上面沒有以上問題，不妨過夜培養看看。至於中途放到4度5分鐘…幾乎不會有影響，除非是溫度敏感的菌株。再有，你所謂的環狀dna是指質粒麼…是的話，它並不是大腸桿菌生長所必須的，但是如果它帶有篩選標記的話，對於大腸桿菌在篩選平板上生長就是必須的。
多放一會

沒轉進去菌落在抗性培養基上是轉不出來的。環狀DNA（質粒）上有抗性基因是菌落坐在加抗培養基上生長所必須的。4度即使放5個小時也不會有太大影響就是可能菌落長得慢一點。五分鐘不可能有影響的。建議換個感受態細胞來轉化把

贊同樓上提出的做對照實驗的建議～另外補充幾條：

1. 質粒大的情況下菌不太好長，可以用2倍濃度YT培養基替代普通LB2. 電穿孔轉化通常比熱休克效率更高3. 可以試試不同的E. coli strain，比如我通常用DH5A，感覺比DH10B效率更高4. 可以適當增高塗盤時菌液的量5. 請再次確認菌先在無抗生素的培養液中恢復培養45分鐘-2小時後，再塗有抗生素的盤...（我真的見過有人把菌放在LB+Amp裏恢復培養的..捂臉，能長出來算你厲害）如果完全沒有長出菌落，比較可能的還是轉化的過程出了問題。如果只是連接問題的話，應該多少還是會有自連的載體進入而長出菌落的。不過克隆試驗裏可能出現的問題很多～具體情況還是要具體分析哦～
沒有連接成功也是有可能長出來的，因為酶切後的質粒載體即便沒有連接成功，轉化進入大腸裡面，細菌還是會修復好載體的。質粒對細菌在你的選擇培養基上生長是必須的，因為相關抗性基因在質粒上。放4度不會有什麼影響。如果過夜沒有長出來，可以到24小時，但是24小時之後長起來的一般都是不正確的微菌落。克隆新手都需要多練幾次，如果幾次都不行，買一個現在的一步克隆試劑盒，基本上都可以的。
應該是長不出來了，假如是37度裏。長不長決定與有沒有帶抗性的質粒轉進去。放冰箱裏沒事，拿出來能繼續長的。不長可能是你感受態細胞不新鮮了，重做新鮮的試試吧。

說白了就是因為各種原因轉不進去或者死了。

現在空氣中的抗性菌比較多了，放得太久長出來的都是雜菌，沒用。

有些質粒需要轉化塗板24小時才能長出來單菌落。

感受態細胞的狀態影響最大，我有轉化率很高的感受態，有興趣的話可以給你試試。
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