HPLC：高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography HPLC)又稱"高壓液相色譜"、"高速液相色譜"、"高分離度液相色譜"、"近代柱色譜"等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，採用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩衝液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離後，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。該方法已成為化學、醫學、工業、農學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術。

問：什麼是HPLC的「無限直徑效應"？

答：

在HPLC分析中由於使用了高效微粒固定相及高壓流動相，樣品以柱塞式注入色譜柱後，因柱的阻力大，樣品分子在柱中的分子擴散很小，直至它從色譜柱流出也未與色譜柱內壁接觸，因而引起的色譜峰形擴展很小，能保持高柱效。

問：用HPLC 進行分析時保留時間有時發生漂移，有時發生快速變化，原因何在？如何解決？

答:

關於漂移問題：

1． 溫度控制不好，解決方法是採用恆溫裝置，保持柱溫恆定

2． 流動相發生變化，解決辦法是防止流動相發生蒸發、反應等

3． 柱子未平衡好，需對柱子進行更長時間的平衡

關於快速變化問題：

1． 流速發生變化，解決辦法是重新設定流速，使之保持穩定

2． 泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。

3． 流動相不合適，解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內進行適當混合

問：液相色譜中峰出現拖尾或出現雙峰的原因是什麼？

答:

1． 篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。

2． 存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子。

問：HPLC 靈敏度不夠的主要原因及解決辦法？

答:

1． 樣品量不足，解決辦法為增加樣品量

2． 樣品未從柱子中流出。可根據樣品的化學性質改變流動相或柱子

3． 樣品與檢測器不匹配。根據樣品化學性質調整波長或改換檢測器

4． 檢測器衰減太多。調整衰減即可。

5． 檢測器時間常數太大。解決辦法為降低時間參數

6． 檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。

7． 檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。

8． 記錄儀測壓範圍不當。調整電壓範圍即可。

9． 流動相流量不合適。調整流速即可。

10． 檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。

問：做HPLC 分析時，柱壓不穩定，原因何在？如何解決？

答：

原因可能有：

1． 泵內有空氣，解決的辦法是清除泵內空氣，對溶劑進行脫氣處理；

2． 比例閥失效，更換比例閥即可；

3． 泵密封墊損壞，更換密封墊即可；

4． 溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法；

5． 系統檢漏，找出漏點，密封即可；

6． 梯度洗脫，這時壓力波動是正常的。

問：為什麼HPLC 柱驗收測試時柱壓過高？

答：

柱壓過高是HPLC 柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常並不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。

1． 拆去保護預柱，看柱壓是否還高，否則是保護柱的問題，若柱壓仍高，再檢查；

2． 把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查；

3． 將柱子的進出口反過來接在儀器上，用 10 倍柱體積的流動相衝洗柱子，（此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進入流動池）。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查；

4． 更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質，正是這些雜質將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯繫。 一般情況下， 在進樣器與保護柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題。

問：色譜柱中的流動相會排幹嗎？

答：

不少做色譜分離試驗的人遇到過這樣的情形：不慎未及時補充流動相，泵將溶劑瓶中的流動相吸幹了，HPLC系統由此而停止工作了。如此情況是否會損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動相都排幹了？色譜柱還能使用嗎？事實上，如果泵將溶劑瓶中的流動相吸干，並不會造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會將空氣排入色譜柱。因為泵只能輸送液體，而不能輸送空氣。

相比之下，另一個更可能發生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣，整個色譜柱乾涸的情況不太容易發生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個毫米變幹了，因揮發掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當長的時間。即使色譜柱真的變幹了，也不一定就不可救藥了。可以嘗試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑（如經氦氣脫氣的甲醇）沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助於浸潤填料表面；已脫氣的溶劑應該能夠溶解並去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要（以1mL/min的流速）沖一個小時或更多的時間被徹底浸潤，恢復到正常狀態。

問：為什麼會基線漂移？

答：

原因

1. 柱溫波動。（即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差檢測器、電導檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。）

2. 流動相不均勻。（流動相條件變化引起的基線漂移大於溫度導致的漂移。）

3. 流通池被污染或有氣體

4. 檢測器出口阻塞。（高壓造成流通池窗口破裂，產生噪音基線）

5. 流動相配比不當或流速變化

6. 柱平衡慢，特別是流動相發生變化時

7. 流動相污染、變質或由低品質溶劑配成

8. 樣品中有強保留的物質（高K』值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現出一個逐步升高的基線。

9. 使用循環溶劑，不提倡。未調整檢測器。

10. 檢測器沒有設定在最大吸收波長處。

解決方法

1. 控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器

2. 使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動相在使用前進行脫氣，使用中使用在線脫氣或氦氣脫氣。

3. 用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用鹽酸）

4. 取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。

5. 更改配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速。

6. 用中等強度的溶劑進行沖洗，更改流動相時，在分析前用10-20倍體積的新流動相對柱子進行沖洗。使用離子對試劑、緩衝鹽更應注意平衡柱。

7. 檢查流動相的組成。使用高品質的化學試劑及HPLC級的溶劑

8. 改變分析條件。使用保護柱，如有必要，在進樣之間或在分析過程中，定期用強溶劑沖洗柱子。

9. 重新設定基線。使用新的流動相。

10. 將波長調整至最大吸收波長處。重選檢測波長。

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