摘要：

原核表達系統在表達有價值的重組蛋白、酶及治療性製品方面是有優勢的。傳統的微生物技術已經逐步進化並與先進的技術合併，以求爲了促進產品代謝產物、重組生物製品、工業化酶的表達。近來，一些先進的手段已經應用於細菌表達平臺以促進重組蛋白的表達。這些方法包含使用強激活子的代謝工程，新型的載體顆粒，例如：誘導劑、增強劑、蛋白標籤、分泌物信號、克隆用的高通量設備以及篩選過程和發酵技術。大腸桿菌中新技術的改進導致不容易表達複合產物，包括小肽、抗體片段、少量蛋白以及大量的全序列糖基化單克隆抗體。Wacker的分泌技術，誘導物、無細胞系統、翻譯後修飾的菌株工程，如二硫鍵的連接和細菌的N端糖基化，在大腸桿菌中表達複合蛋白和多肽的有效性方面仍需評估。

本文提供了一個概念：近來較爲流行的在大腸桿菌中提高外源蛋白表達的表達技術，最爲重要的是在微生物和生物製藥中的應用。

前言

很多微生物製品具有重要的工業和研究價值；然而它們從自然界不容易獲得。大腸桿菌的重組DNA技術提供了一個高表達水平和可放大的過程的很有潛力的方法，此方法的成本低廉。

任何生物製藥的商業化的成功依賴於其可大量表達重組製品的有效放大的能力。其次，隨着放大產品產量的增加，成本可最小化。使用生物基因學改造的重組蛋白製品的製備過程需要：1、選擇一個合適的克隆載體、克隆元素和宿主；2、穩定的、高產量、高表質量的重組克隆代次；3、可放大的、一致的、高產量的及優化的發酵過程；4、低成本和便捷的純化過程。

在製備重組蛋白方面，大腸桿菌是最優的表達系統（圖1）.由於使用新型的誘導劑，誘導後蛋白在短短的6小時內過表達。據報道，大腸桿菌可以以摺疊的、可溶的、功能性的形式表達人變異型基因工程溶菌酶，而且只需一步純化過程。

大量數據表明，大腸桿菌表達系統在表達重組蛋白方面是一個高表達系統。例如單序列的結合以及Wacker分泌技術：提高蛋白在大腸桿菌周質腔和胞外分泌表達的效率。在N段或C端加不同的標籤（Fh8, SUMO, His, TRX and BMP標籤）以增強蛋白的可溶性和純化親和力。隨着細菌培養溫度30, 28, 23, 10, 15 或 4C逐步降低，表達蛋白的可溶性顯著增加。此外，低溫可以增強蛋白的穩定性和正確摺疊。密碼子的最優化可成倍增強蛋白表達。先進的高通量篩選設備和優化發酵過程可以提高蛋白表達。實現DOE（實驗設計）和在最新型的迷你反應器中優化上游過程，可大大縮短研發時間並使蛋白表達量成倍增加。使用通用的嚴格控制的表達體系，新型的激活子和大腸桿菌糖工程細胞，可以確保高水平表達出需要的重組製品。而且，對於宿主/菌株、載體、過程和提高重組製品表達效率新技術的改進還有繼續開發的餘地。

一種常用的宿主：大腸桿菌

大腸桿菌無論在學術界還是生物製藥工業界都是一種最常用的重組蛋白表達系統，由於其遺傳學性質已被熟知。很多在世界範圍內已被廣泛應用於臨牀的生物藥物（表1）都是由大腸桿菌表達的。

圖1：常規蛋白製造流程

表1 被批准的治療性生物蛋白和它們的臨牀適應症的最新列表

大腸桿菌表達系統較其它表達系統具有多種優勢，因爲其細胞生物學性質已經被熟知，易於操作，簡單的發酵過程，以及低成本製造和可大量表達重組蛋白。在最近的研究中，大量的治療性蛋白和工業化酶使用大腸桿菌作爲宿主來表達（表2）。在大腸桿菌中，目標蛋白可以在胞內以不可溶的蛋白聚合物的形式表達爲包涵體，還表達爲可溶的分泌型蛋白。

這種表達系統的其它缺點爲，重組製品的製備爲非功能狀態，這是因爲在大腸桿菌中不能進行翻譯後修飾。如果蛋白以包涵體的形式表達，下游過程是十分繁瑣的。在大腸桿菌中包涵體的形成是由於所需細胞器的缺失以及外源蛋白在細胞質中的過表達。爲了克服這是挑戰，在大腸桿菌的周質腔或者在胞外空間通過合併合適的信號肽序列來表達重組蛋白，這種表達方式可以使蛋白正確摺疊並可使蛋白水解儘量降到最低。這種信號序列可以從自然界獲得，也可以通過先進的生物信息學工具設計合成。大腸桿菌BL21(DE3)和K12宿主已被廣泛用於製造各種生物藥製品。

這裏有多種分子工具和方法可以高水平表達外源蛋白，例如大量的表達質粒，工程宿主和生長培養策略。大腸桿菌可用於表達從低分子量蛋白到相對的高分子量蛋白以所需產量。然而，困難的表達蛋白時，這就不適用。

提高大腸桿菌表達水平的最新技術

很多新型的技術和高產量方法用於大腸桿菌的克隆和過程的改進。更大的挑戰在於發展快速的可放大的重組蛋白和酶的生產過程。預測最佳的表達系統是不切實際的，載體顆粒、分泌信號、蛋白生產條件以及基於外源蛋白特性的發酵過程。雖然對於重組蛋白製品來說，大腸桿菌表達是最佳的表達系統，它不能像真核宿主那樣，以分泌的形式製備正確摺疊的具有活性的蛋白。結果是，以下在本文中描述多種方法和平臺技術在大腸桿菌中表達目標蛋白。一些先進的技術（圖2）在大腸桿菌中用來表達更好質量和大量的外源蛋白也有所描述。新型技術與傳統技術相比存在的一些優勢和劣勢在表3中有所描述。

在大腸桿菌中的密碼子最優化基因表達

在工程宿主中功能蛋白的有效表達是各種新型平臺技術的首要基礎。不幸的是，當表達宿主過量轉化時，基因不會得到有效表達，這是因爲在不同的生物體中有不同的密碼子序列。近些年已經證實，密碼子的替換顯著影響蛋白摺疊和基因表達水平。

合成生物學的基礎技術的目標在於創造一個包含合成和設計基因的改良生物體，其用於製造重組治療性蛋白，工業酶和生物燃料。使用標準生物學和受控的因素來建立各種新型的平臺，包括誘導物、激活子、核糖體結合位點（RBSs）、轉錄終止劑等。進一步講，合成生物學提供了過多的基因要素，如激活子、終止劑、誘導劑和RBSs，有能力提供各種水平的蛋白表達。目前，在學術界和生物製藥界，使用大腸桿菌系統，密碼子優化基因被廣泛的應用於表達研究和外源蛋白的有效生產。

與十年前相比，合成基因沒有表現出優勢，並且大量的 DNA合成片段可以根據需求被改造。進一步講，它們可以組裝成一個完整的基因用於克隆。密碼子的優化方法可以使蛋白表達水平提高几倍。密碼子的最優化過程或生物合成路徑的重新設計促進重組蛋白和代謝產物的體積產量。這可促進低成本過程和產品的生產。此外，它還影響生物技術的經濟學可行性。

表2 工業化重組蛋白製品

圖2 在大腸桿菌中的過程和產量的技術創新的建議流程

表3 先進技術的優缺點

用新型的啓動子來提高表達

在原核宿主中高表達重組蛋白是一個主要突破。T7噬菌體聚合酶識別T7噬菌體啓動子系統（T7 p/p系統）廣泛應用於原核系統載體元素來製備蛋白製品。然而觀察到，當使用這種聚合酶和啓動子系統3-5代後，蛋白製品的表達量逐漸降低。爲了克服這個難題，應用了很多策略，遺憾的是沒有被充分證明有效的方法。在很多情況下，這個表達系統很好，並且表達出的目標蛋白佔總細胞蛋白的50%以上。

近來，啓動子在大腸桿菌中用於表達外源蛋白，可有很高的蛋白產量。然而，這些啓動子不能穩定的表達所需要的大量的重組蛋白。在多種情況下可以觀察到蛋白表達量的降低，這會導致在工業生物製藥中高的製造成本以及質量的不一致性。

在連續培養中表達量降低的問題被一種新的策略所解決，表達T7C p/p系統，它可以從連續生長培養中去除不工作的細胞。這個系統不同於通常使用的啓動子，在通常的啓動子中，隨着功能聚合酶、T7 RNA聚合酶啓動子的丟失而誘導產生的死細胞，和其它的一些差錯的發生，都會影響重組蛋白的表達。因此，含有目標基因的重組細胞可以在培養中維持，穩定的高水平蛋白表達可以實現。

一個新型的T7C p/p系統已經在一個表達暗盒（名爲ECKm暗盒）的基礎上發展，這個表達暗盒是被一個T7啓動子引入的表達載體所控制的。選擇標記卡那黴素抗性誘導物基因編碼APH與ECKm暗盒結合，用於克隆篩選和選擇。轉錄終止序列被插入到APH基因的5,末端，用來聚合酶的選擇標記卡那黴素的表達。非噬菌體啓動子通過轉錄終止基因插入ECKm暗盒，來阻止選擇標記的表達。因此，選擇標記APH基因的表達嚴格的被T7-噬菌體啓動子所控制，因此新型的暗盒表現出所需的特徵。新型的結構設計促進了大腸桿菌表達平臺中目標蛋白的蛋白生產效率以及成本的競爭。

進一步講，大量的實驗用來評估新型的啓動子系統，都成功實現了高水平長週期的蛋白表達，而且沒有任何缺陷。這種新型的啓動子T7C p/p系統是用於增強已經被廣泛應用的T7-phage RNA 聚合酶/T7 啓動子基礎表達系統。這種新型的啓動子系統可以大大提高重組蛋白的產量，無論是在小規模還是在放大規模，無論在學術界還是在工業級生物製藥界。新型啓動子系統的應用還可以降低純化成本。

Cumate 誘導型 一種新型的表達系統

一種嘗試向重組蛋白製備的挑戰，各種載體和表達系統都發展起來。一種更好的啓動子可以增強大腸桿菌RNA的轉錄，是通過更換通常所用的T7噬菌體或其它啓動子來完成的。一個穩定結構或嚴格控制的啓動子，目標基因可以在上游克隆，可達到高水平蛋白產量。一種自誘導啓動子也可用於大腸桿菌中穩定基因的發展和蛋白的表達。

近來，一些新型的嚴格控制的載體系統已經應用於大腸桿菌中高水平表達蛋白，其中，Pseudomonas putida F1 cym 和 cmt操縱子標準元素被應用。通過使用化學誘導劑cumate，這兩種操縱子控制目標基因的表達在轉錄調節水平。與IPTG不同，一種無毒的化學誘導劑cumate在表達暗盒中誘導基因的轉錄組裝。一種特殊的pNEW載體被創造用於蛋白表達，這種載體使用cumate基因開關，包含一個局部的T5噬菌體啓動子結合一個合成的操縱子以及目的基因的組成結構表達的抑制物蛋白cymR。

Cumate表達系統有很多優勢，比如1：與IPTG誘導pET表達系統相比有更高的產量；2、嚴格規定的基因表達；3、充分的誘導以及均勻的蛋白製備；4、使用不同濃度的Cumate進行表達優化；5、由於誘導後8h細胞仍然被誘導，所有高產量。

與pET-based IPTG誘導系統相比，Cumate-based pNew載體可以有3-6倍的表達量。在工業化蛋白和酶方面，這個系統提供改進的和更高水平的表達量。提高了的表達量可以減少發酵、純化、原材料消耗花費。

關於大腸桿菌工程中二硫鍵的形成及糖基化

在任何蛋白中蛋白的摺疊和二硫鍵的正確連接對於蛋白的穩定和生物學功能都是十分重要的，蛋白的正確摺疊取決於二硫鍵的連接，這在重組製品的翻譯後修飾方面是十分重要的。二硫鍵的形成和正確摺疊在真核（酵母、昆蟲、哺乳動物）細胞中更加高效。在大腸桿菌的周質空間中，正確二硫鍵的形成需要一個氧化還原環境，例如在大腸桿菌的周質空間中存在二硫化物異構酶（Dsb蛋白）和PP異構酶（PPIase）。這些都可以促進目標蛋白形成正確的二硫鍵。

在大腸桿菌中獲得二硫鍵蛋白是通過在重組蛋白的N端編入各種信號肽，通過大腸桿菌分泌途徑（SEC）依賴途徑或者信號識別顆粒（SRP）依賴移位機制，將外源蛋白轉移至大腸桿菌細胞的周質腔或保外環境中。大腸桿菌周質腔中外源蛋白的正確摺疊可以通過：分子伴侶的聯合表達、蛋白二硫鍵異構酶（PDIs 或PPIases）和二硫鍵形成催化劑（Dsbs）來增強。分子伴侶的聯合表達以及Dsbs和PDIs的存在可以促進生物活性產量的提高以及蛋白的正確摺疊。轉基因宿主在大腸桿菌中正確摺疊蛋白的表達方面具有商業化價值。

大腸桿菌的糖基化在宿主細胞工程中是一個突破。空腸彎曲桿菌的N端糖基化系統，並將它轉移至大腸桿菌，可以將蛋白簡單糖基化。某某通過結合pgl途徑，成功的在大腸桿菌中製備了糖基化重組蛋白。Pgl是彎曲桿菌中一個被識別的基因簇，在其中，第一次發現原核N連接蛋白糖基化。同樣的方法可以應用於單克隆抗體、抗體片段和其它重組蛋白的N端糖基化。

使用信號序列來增強細胞分泌效率

至今，很多重組蛋白都是在大腸桿菌的胞外環境或周質腔中表達。爲了將重組蛋白從胞內轉運，它們被設計成沿着N端信號肽表達，這樣表達的蛋白可以通過宿主轉移子轉移至以上環境中。

分泌的信號肽（SPs）是一種以蛋白爲靶向的被熟知的序列，可以在真核系統中將蛋白通過內質網和高爾基體膜運輸。通過大腸桿菌的分泌途徑轉移位置後，大部分蛋白被分泌到培養上清液中，但是由於缺少分泌機制，蛋白通常以聚體或包涵體的形式累積在細胞中。因此，通過細胞設計或使用信號序列，可能會在大腸桿菌的周質空間或胞外環境指導蛋白的表達。

信號肽的設計對於在大腸桿菌中重組蛋白、小肽、抗體片段的表達效率和分泌是十分重要的。已經證明，設計的蛋白從SAP1天然信號序列的C區域導致不同的表達分泌速率。也證明瞭，重組蛋白的總產量可以通過優化大腸桿菌的信號系列來增加。細菌種屬G1的一個外源信號肽被優化表達環糊精葡萄糖基轉移酶（CGTase）至大腸桿菌的周質腔和胞外環境中。爲了優化更高的蛋白產量，8個信號序列的突變體與CGTase基因一起被創造和克隆，用來爲周質腔和胞外表達評估和鑑定一個最佳的信號序列。於野生型序列相比，這個信號序列突變體分別引起94%和110%胞外和周質的蛋白分泌。這個信號序列在正確摺疊的蛋白的表達效率方面也有潛力。

一個最新發展起來的ESETEC Wacker’s分泌技術是一個新型分泌平臺的很好例子，它可以在大腸桿菌的胞外環境中製備大量的重組蛋白。這個系統證明，新穎和高效使得天然形態蛋白的分泌以及正確摺疊的重組製品分泌至胞外環境，可以促使下游過程低成本的發展。當使用ESETEC Wacker’s分泌技術時，生物活性重組ScFv 和Fab的純化產量分別爲3.5g/L和4.0g/L，與之相比，當使用不同的克隆策略、菌株和培養條件時，純化產量僅爲0.5 mg/L 至400 mg/L。

ESETEC系統基於2步輸出機制：1、目標產物通過2步路徑轉移至周質空間；隨後，信號肽裂解，原始產物釋放出來；2、正確摺疊的產物由周質空間轉移至胞外環境。在培養中獲得高產量7.0g/L的高純度分泌蛋白。當優化的條件提供給羅曼士（DE3）菌株時，通過DsbA衍生信號序列裝配的小片段蛋白也以分泌的形式表達。

各種革蘭氏陽性菌被也用來分泌重組蛋白，包括胞外環境的小抗體片段。由於外膜的缺失，直接分泌重組蛋白到培養基中，這反而會促進發酵規模的放大和降低成本。

Pfenex表達系統

如前面段落所描述，隨着多二硫鍵作爲分泌產物，重組蛋白的製備十分困難，並且在大腸桿菌平臺是一項挑戰性工作。爲了克服這個困難，Pfenex開發了一種綜合性的基於熒光假單胞桿菌的蛋白製備平臺，可成功的用於製備高產量的功能蛋白。熒光假單胞桿菌的新型的基因修飾菌株庫已經被用於高通量篩選和重組抗體片段的製備。這個菌種庫包含上千種由大量基因片段編入宿主菌構建的基因設計的P. fluorescens表達菌株。在選擇菌株上的大量的篩選和鑑別實驗，可以爲發酵和功能性治療蛋白的製備鑑別出最終的菌株。菌株篩選和發酵過程大約4周完成，並可成功獲得超過1.0g/L功能Fab。

摺疊酶和分子伴侶的協同表達

大腸桿菌中重組蛋白的過表達經常導致錯誤摺疊的蛋白以包涵體的形式積累。以前的研究證明，大腸桿菌中蛋白的摺疊式一個能量依賴過程，通過兩級分子伴侶來調整：DnaK-DnaJ-GrpE 和GroEL-GroES系統，這可以抑制表達蛋白的聚集以及促進正確的蛋白摺疊。這些伴侶可以控制很多細胞機制，如大腸桿菌的基因轉錄，蛋白裝配和膜運輸，以及促進表達，純化和外源蛋白的摺疊。

分子伴侶是一種摺疊酶，來促進蛋白摺疊和正確結構的形成。爲了防止形成包涵體和促進蛋白的形成，分子伴侶用來協同表達。這些伴侶通過插入表達的蛋白來觸發蛋白摺疊，併爲正確的摺疊和蛋白結構形成蛋白伴侶複合體。

近來，在大腸桿菌中表達人ALDH3A1角膜晶體蛋白十分困難，這是由於它的低溶解性、低產量和不夠高的純度。因此，爲了促進重組ALDH3A1的溶解性和表達，蛋白被融合了6個his標籤並與兩組分子伴侶：GroES/GroEL 和 DnaK/DnaJ/GrpE.共表達。結果，在大腸桿菌中，大量的可溶蛋白和活性的重組ALDH3A1蛋白被製備出來。

近幾年，一種基於大腸桿菌的無細胞表達系統被試着作爲一種替代系統，被用來克服基於細胞的表達方法帶來的限制，這是由於無細胞系統與基於細胞的系統相比，製備功能蛋白更加簡單和經濟。大腸桿菌無細胞系統可以製備出可達到1.0mg/ml的合成蛋白。然而，在無細胞系統中合成的高濃度的功能性Fab，據報道目前爲止產量僅爲30微克/ml。爲了促進可溶的和功能性的Fab片段的合成，在系統中加入大腸桿菌伴侶（GroE 和DnaK）以及蛋白二硫鍵異構酶（PDI）。進一步，爲了使無細胞系統更加經濟可行，需要進一步大量的實驗。

LEA肽的聯合表達

一種最近的胚胎髮育重組的LEA類似肽被用來增強在大腸桿菌中聯合表達重組蛋白。這種LEA蛋白是親水性和天然的非聚合型的，它可以防止大腸桿菌表達的其他目標蛋白聚體的形成。LEA肽被用來聯合表達的研究，由11個氨基酸殘基組成，可以顯著增強目標蛋白的表達。在大腸桿菌中，GFP蛋白與LEA肽結合或者不結合，可以提高蛋白表達量到50%。

-5和-3端標籤

大腸桿菌系統中一個主要的挑戰是表達出的蛋白以不可溶聚合物包涵體的形式累積和表達的量很低，這是由於表達的蛋白在細胞質中的錯誤摺疊。爲了克服以上問題，大量的蛋白標籤被用來評估降低聚體的形成以及蛋白以可溶的形式表達。融合標籤常被用於改善蛋白的可溶性和純化過程。在克隆設計中，這些標籤常被融合在目標蛋白的N端或者C端。然而，在蛋白生產中的主要挑戰是在純化的不同步驟中，如何將融合標籤裂解和去除。爲了實現這個目的，多種酶切位點被設計出來，以便正確的蛋白表達和裂解。

多種蛋白標籤（His6, GST, MBP, NusA, Trx 和SUMO）可能作爲融合標籤，在大腸桿菌中被用於製備可溶的、有活性的或部分活性的蛋白。 His標籤（包含6各或更多連續的組氨酸殘基）是一種廣泛應用的標籤，被有效的應用於融合蛋白的親和純化。隨後的表達，融合蛋白使用Ni-NTA親和純化系統被純化，His-標籤在之後的步驟中被蛋白酶移除。

第二種融合標籤SUMO被用於在大腸桿菌和高等真核生物中可溶性蛋白的表達，這可大量提高在大腸桿菌、酵母菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞平臺中，蛋白產量，摺疊和目標蛋白的可溶性。SUMO融合物可將重組肽和重組蛋白的產量提高5-50倍。這種可溶蛋白很容易被純化，而且使用SUMO蛋白酶很容易被去除。

已經證明，在大腸桿菌胞內表達的，融合了His和SUMO標籤的肽，可以使用SUMO蛋白酶-1被完全去除。另外一種基因工程標籤（HaloTag7），已經被證明可以提高細菌中可溶性蛋白的表達。HaloTag7被評估可以在大腸中表達大約23中人蛋白，其中的74%以可溶的形式表達。使用His和SUMO標籤克隆出骨形態蛋白14（BMP-14），並以可溶的形式在大腸桿菌中成功的表達出來。這種蛋白在隨後的純化中使用Ni-IDA層析純化，純度可達90%。這種SUMO標籤在大腸桿菌中表達重組肽和蛋白中都是高效的。

新型的標籤Fh8（Histag）是一種具有潛力的標籤，可用於增強重組蛋白的可溶性以及粗純。Fh8是一種低分子量標籤，在重組蛋白的製備中，可被當做高分子量融合標籤應用。在Fh8最初的研究中顯示，與不使用融合標籤的蛋白製備相比，使用此融合標籤的蛋白表達量是3-16倍。進一步的研究，Fh8融合技術證明，與其他普遍使用的融合標籤（MBP、NusA、Trx）相比，融合了這種標籤的融合蛋白可以得到更高的產量。

其他融合標籤，如TrpLE，類固醇異構酶，PurF和PagP被用於不可溶的表達。這種融合物可引導宿主細胞表達的蛋白成爲多種包涵體形式，並且使用常用的裂解劑後容易被溶解和純化。隨後，使用洗滌劑或金屬離子催化肽鍵裂解劑，這些標籤可以被移除。

大腸桿菌過程優化

大腸桿菌系統中培養基、種子和發酵參數的優化，需要培養成分和生物過程參數的大量積累。蛋白生產中的碳源是一種主要的培養成分，它可以影響細胞代謝和蛋白產量。培養基中碳源和其副產物在目標基因的轉錄和翻譯方面發揮了重要的作用。通過降低酶的合成，碳源提供了優良的生長。

培養基中副產物醋酸鹽的累積引起了低水平的重組酶和蛋白製備。爲了避免培養基中醋酸的積累，細胞在一個相對較低的生長速率，這反而會引起一個高的細胞蛋白濃度。醋酸的累積可以通過在微生物培養中將葡萄糖維持在一個最優的水平來控制，在培養中將醋酸的累積維持在低水平，可以維持pH並可將細胞和蛋白濃度達到高水平。進一步講，通過優化基礎培養基、種子和發酵參數設置，一個粗的連續的補料過程可以被改善。通過基礎培養基，初始細胞生長和蛋白製備可以完成，但在fed-batch過程中，營養物耗盡及細胞的持續生長是通過補加補充物來完成的。

已經證明，大腸桿菌培養基的優化可使工業化木聚糖酶高產。一個2L規模攪拌式罐發酵結合培養基組分的優化被用於評估在大腸桿菌DH5α中木聚糖酶的生產。葡萄糖和硫酸銨濃度的優化使木聚糖酶生產具有最優的參數，並且發現10g/L葡萄糖和2g/L硫酸銨濃度是木聚糖酶生產的最優濃度。最優的培養基組分和溶氧水平，十分在大腸發酵製備木聚糖酶達到一個更高的水平。

發酵過程發展的最大挑戰是，補料策略及放大過程參數的優化，而重組蛋製品產量和質量沒有明顯改善。在早期的開發中，在小規模試管和燒瓶中進行發酵過程的優化。然而，當過程放大並在受控的發酵環境中進行重現時，有很多限制和缺陷。爲了解決這個難題，某某引進了一種新型的小型24微型反應器系統，它比搖瓶、大規模常規的發酵具有多種優點。這種24孔反應器近來被用於培養基和種子的篩選，參數的優化和克隆篩選。24孔微型反應器的應用可節省時間和成本。

最近，突變的AvPAL基因的製備通過優化培養條件被增加。AvPAL的突變體在Novagen’s pET28a表達載體中被克隆，併爲蛋白的製備提供了一個合適的培養條件。培養參數，如誘導劑IPTG的各種濃度，誘導時間和生長溫度，攪拌轉速和各種類型、來源的培養基被用來評估最優的表達。通過研究這些參數，培養溫度（25℃）和IPTG濃度（0.5mM）可在大腸中促進突變體AvPAL的製備。

一個類似的方法被用來在大腸中優化製備真核酶製備。初始種子密度，培養溫度和誘導持續時間被評估，可使得重組酶的高表達。當培養使用IPTG誘導，在OD600=0.1，並且誘導溫度爲4℃，48-72h時，可獲得大約3倍的產量。這個方法可以用於在高溫時容易失活的溫度敏感蛋白的製備上。

小結

重組DNA技術在微生物技術中製備酶和生物治療性製品方面是一種非常有效的技術。隨着各種新型表達技術的進步，如啓動子、宿主修飾、分泌信號和過程優化，在短時間和低成本下製備克級產量的蛋白變得容易。新型技術的應用，使得高產、低成本工業化製備治療性和非治療性製品變成可能。與廣泛應用的工業化標準pET表達系統相比，pNew載體的引入可獲得3-6倍的表達量，這個表達平臺還可用於製備難於表達的複合和融合蛋白。Wacker的新型分泌技術可促進胞外蛋白的表達；一種可溶的和正確摺疊的蛋白可以通過Wacker的修飾的菌株獲得高產（可達7.0g/L）。通過各種融合體的加入，包括Fh8，在大腸中製備可溶蛋白是很有幫助的。以上的方法可降低純化和整個蛋白製備過程的消耗。

此外，小型多孔生物反應器的應用，可以在有限的時間和資源內提高克隆篩選速率和優化上游過程。因此，表達平臺，宿主，載體的選擇和發酵過程的優化在重組蛋白的製備發展中起到關鍵作用。