前兩天NPR報道了關於美國首批結合了基因編輯工具CRISPR/Cas9和過繼性T 細胞療法的臨牀試驗，比較巧的是今年一月的時候正好老闆在羣裡邊也有和我們討論到賓大的這項臨牀。所以想要寫篇文章討論一下這項臨牀試驗的技術策略和意義。

報道原文鏈接如下：

https://www.npr.org/sections/health-shots/2019/04/16/712402435/first-u-s-patients-treated-with-crispr-as-gene-editing-human-trials-get-underway?

www.npr.org

所以下面我會大致從這麼幾個方面對這項臨牀實驗進行討論：

1. 簡單的背景介紹：過繼性T細胞免疫治療,基因編輯以及CRISPR/Cas9.

2. 具體到這項臨牀試驗：技術層面的策略分析；

3. 潛在的風險。

4. 顯著的意義。

下面開始正文。

  1. 簡單的背景介紹：過繼性T細胞免疫治療,基因編輯以及CRISPR/Cas9.

作為癌症免疫治療中的當紅炸子雞，過繼性T細胞免疫治療的流程大致如下：

圖片出處見右下角水印

Step1 : 從病人的外周血中分離出T淋巴細胞；

Step 2 : 將T細胞在體外激活/富集後作一定的基因修飾（也有的方法是使用特定的腫瘤抗原進行刺激，而不作基因層面的修飾）；

Step 3: 將基因修飾（或者做了特殊處理）的T淋巴細胞輸注回病人體內，實現腫瘤抑制/清除的效果。

這裡著重說一下對於T細胞做的基因修飾，也就是我們常說的基因編輯，最基本的改動是將兩類受體基因整合至T細胞的基因組：

一類是能夠特異性識別腫瘤靶蛋白多肽-MHC複合物的T細胞受體（T Cell Receptor, TCR)基因，一類是能夠直接特異性識別腫瘤靶蛋白的嵌合抗原受體基因（Chimeric Antigen Receptor, CAR)。這二者之間的區別和聯繫，請看下面的傳送門：

癌症免疫細胞治療知識：CAR-T與TCR-T的區別在哪裡？--轉載 - nkwy2012 - 博客園?

www.cnblogs.com圖標

而這裡值得一提的是這步基因編輯的實現方法。雖然現在我們一談到基因編輯，就想到CRISPR。但是實際上在TCR-T或者CAR-T的製備過程中，目前較為主流的方法仍然是通過慢病毒（lenti-virus)或者轉座子（Transposons)的方法，來實現特定基因在T細胞基因組中的整合。這兩種方式相比於CRISPR系統，主要有兩個特點：一是基因插入的隨機性。CRISPR系統由於存在gRNA作為嚮導，能夠實現在靶位點的精準插入，而慢病毒或轉座子的基因整合方式則是隨機的。二是實現高效knock-in的可操作性。以慢病毒為例，一個普通的慢病毒製備/感染平臺，通常CAR或者TCR的整合效率能達到50%左右，優化之後甚至有的能達到90%。而使用CRISPR，目前世界頂尖的實驗室平臺，效率也只有50%-80%不等。

所以綜上所述，目前國內外CAR-T/TCR-T臨牀試驗中主要的採用方法，依然以慢病毒為主，轉座子次之，CRISPR再次之。但是鑒於慢病毒工藝的複雜性和高成本，以及前兩種方法隨機插入存在的未知風險，並且隨著以AAV、電轉等遞送平臺的進一步提升，未來的趨勢必定是以CRISPR為主的基因準確敲入作為主要策略。

而根據之前賓大的Carl June等團隊發的paper，猜測他們的總體流程應該是先通過慢病毒構建TCR-T，然後以電轉的方式，使用CRISPR/Cas9對三個基因進行敲除。

2. 具體到這項臨牀試驗：技術層面的策略分析

前面簡單介紹了一些背景知識，主要目的就在於說明：基因編輯技術並不侷限於CRISPR，並且早已應用於臨牀實驗（2010年Bill Ludwig 成為賓夕法尼亞大學第一位接受CAR-T細胞治療的患者）。而我們回到此次引起關注的這項臨牀試驗，作為科研狗我比較關注的幾個點：

首先是TCR靶點的選擇。

從clinical trail 上的註冊信息我們可以知道，此項臨牀使用靶向NY-ESO-1的TCR對T細胞進行重定向，用於治療多發性骨髓瘤，骨髓瘤，滑膜肉瘤以及黏液樣/圓細胞脂肪肉瘤。

正常人中NY-ESO-1蛋白具有高度的組織特異性：只在睾丸組織中表達，是精子形成過程中一個重要的蛋白，但在其他組織中則幾乎檢測不到。而在許多惡性腫瘤（如多發性骨髓瘤，滑膜肉瘤，食管癌等）中，研究者能夠檢測到NY-ESO-1高水平表達，因此這是一個非常理想的腫瘤相關抗原（Tumor Associated antigen, TAA)。

此外，NY-ESO-1作為一個胞內蛋白，較難通過抗體進行阻斷，但是它的肽段能被溶酶體剪切後，被MHC呈遞到細胞表面，然後被特定的TCR識別----這簡直就是完美的TCR-T治療對象。因此選擇這個靶點，就像CAR-T靶向CD19一樣，是個十分穩妥且成熟的策略。而在此基礎上結合CRISPR進行基因編輯，也能夠確保試驗結果不會太糟糕。

其次是使用CRISPR敲除的三個基因，分別是PD-1基因，表達的TCRα鏈的TRAC基因和表達TCR β鏈TRBC基因。

如果關注了2018年生理學醫學獎的朋友應該知道PD-1。它存在的意義在於阻止T淋巴細胞的過度反應，相當於是T細胞的剎車——但是腫瘤細胞會巧妙的利用這個機制，上調自身的配體PD-L1的表達，通過和T細胞表面的PD-1結合，不斷向T細胞內部傳遞抑制性信息，從而造成T細胞衰竭，功能紊亂等等。於是這項臨牀試驗通過CRISPR把PD-1直接Knockout，就直接解除了這個剎車的作用。

另外兩個基因，自身內源性TCR 的α鏈和β鏈。這一步起初我們也看不太懂，

因為目前的Paper中，通過CIRSPR敲除內源性的TCR來構建通用型的TCR-T/CAR-T已經幾乎成為行業共識。但是從Clinical Trail上的信息可以看出來，此次臨牀試驗使用的是自體的T淋巴細胞，所以就不存在免疫排斥的問題。並且如果是為了克服免疫排斥，通常只需要KO其中一條鏈即可，無需兩條同時敲除。

後來從賓大某個團隊的一個PPT中找到了結論：即為了避免出現TCR錯配現象。因為一個完整的TCR由兩條鏈（α鏈和β鏈）構成，並且兩條鏈是分別表達，然後結合形成TCR。因此當我們把外源的TCR轉入T細胞內之後，加上它本身帶有的TCR，這個時候胞內就會存在2種α鏈，2種β鏈。那麼就可能形成四種不同的TCR，這會大大降低外源TCR的陽性率；同時還有一個更嚴重的後果在於，如果其他兩種錯配的TCR能夠識別自身的其他多肽-MHC複合物，那麼會有極高的脫靶風險。所以他們採取同時敲除內源性TCR。

4. 潛在的風險

現在我們說到風險，主要包括兩個方面。

一個是TCR-T本身的臨牀風險: 如脫靶造成的對於正常器官的損傷，炎症因子風暴等等，PD-1 KO之後由於T細胞解除了抑制，激活更加迅速，這種副作用自然也可能更強。不過賓大作為全世界細胞免疫治療行業中的第一梯隊，我們可以認為他們完全有能力控制這方面的風險。

另外一個風險來自PD-1的敲除帶來的風險。從目前獲得的信息來看，他們最終獲得的細胞製品包括以下幾種細胞：PD-1+WT, PD-1- WT, PD-1- TCR NY-ESO-1+, PD-1+ TCR NY-ESP-1+。

我們需要比較關注的是這兩種細胞：PD-1 KO的野生型T細胞，以及PD-1 KO的，靶向NY-ESO-1 TCR陽性的T細胞。上文中有提到，PD-1是T細胞的剎車，把剎車拆了之後，T細胞瘋起來就根本攔不住了。PD-1 KO的，靶向NY-ESO-1 TCR陽性的T細胞瘋起來，會瘋狂殺傷腫瘤細胞，這正是我們想要的；而PD-1 KO的野生型T細胞中，很有可能存在某些可以識別自身肽段的T淋巴細胞，而它一旦飆起車來，受傷的可就是正常的組織了。這種副作用在使用PD-1單抗的臨牀試驗中也時常有出現。

5. 顯著的意義。

在NPR的報道中，顯然把重點放在了「CRISPR&Human Genome Editing"上。並且在文中再次提到了賀建奎的基因編輯嬰兒事件 。

Theres an important difference between the medical studies under discussion here and what the Chinese scientist, He Jiankui, did. He used CRISPR to edit genes in human embryos. That means the changes he made would be passed down for generations to come. And he did it before most scientists think it was safe to try. In fact, there have been calls for a moratoriumon gene-editing of heritable traits.

不過值得慶幸的是，科學家和管理者們並沒有因噎廢食。當時業內人士關於賀建奎事件可能會影響更多的的CRISPR走向臨牀的擔憂並沒有出現：至少在歐美範圍內如此。至於國內如何，需要再去了解一下，畢竟很多一棒子打死的事，我們見的太多了。

最後引用報道中來自加州大學伯克利分校的基因編輯科學家Fyodor Urnov的話來結束：

2019 is the year when the training wheels come off and the world gets to see what CRISPR can really do for the world in the most positive sense.

參考資料：

  1. Ren J, Liu X, Fang C, et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition[J]. Clinical cancer research, 2017, 23(9): 2255-2266.
  2. npr.org/sections/health
  3. Smith Stephen M,Iwenofu O Hans,NY-ESO-1: a promising cancer testis antigen for sarcoma immunotherapy and diagnosis.[J] .Chin Clin Oncol, 2018, 7: 44.
  4. PHASE I TRIAL OF NY‐ESO‐1 REDIRECTED CRISPR EDITED T CELLS (NYCE CELLS)
  5. ENGINEERED TO EXPRESS NY‐ESO‐1 TCR AND GENE EDITED TO ELIMINATE ENDOGENOUS TCR AND PD‐1， NIH OBA RAC Public Review June 21, 2016

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