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基因敲除是自80年代末發展起來的一種新型分子生物學技術，是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術。

通常意義上的基因敲除主要是應用DNA同源重組原理，將目的基因用一段外源DNA序列（多採用篩選基因新黴素）替代，獲得在整個發育時期的全身所有組織和細胞中都不表達該基因的小鼠模型。

然，其缺點有二：

01、很多基因經常時多組織多器官表達的，傳統的全身敲除小鼠的表型是該基因在小鼠的所有組織中敲除的結果，很難研究該基因在某個特定組織中的作用；

02、很多基因（約15%[1]）的突變和缺失極易造成胚胎髮育異常，導致胚胎致死或其他基因的表達失調致動物出生不久既死

問

怎樣才能更準確地研究基因在某組織中的功能，避免胚胎致死或動物出生後不久就死亡這種情況呢？

答

咱們可以採用條件性基因敲除策略，以Cre/loxP為基礎，利用組織特異性啟動子特異性控制Cre在特定組織的表達，以實現在特定組織細胞中對目的基因的敲除或改造，也可以在Cre後加上ERT2，以實現在動物的特定發育時期對目的基因的敲除或改造。

by ALFREDPECHISKER[2]

總而言之就是：通過Cre/loxP系統，想讓目的基因在什麼組織中敲除就能在什麼組織中敲除，想讓目的基因在什麼時間敲除就什麼時間敲除！是不是很酷啊？??

那Cre/loxP系統究竟是什麼呢？我們來詳細了解一下吧！

Cre-loxP重組酶系統

Cre-loxP重組是一種特定位點的重組酶技術，可在DNA的特定位點上執行刪除、插入、易位及倒位，用該系統可以針對特定的細胞類型或採用特定的外部刺激，對細胞中DNA進行修改。在真核和原核系統中均適用。

1987年Brian Sauer博士報道了Cre-loxP重組系統可用在有絲分裂和非有絲分裂細胞中操作特定位點的特異性重組，最初用於激活哺乳動物細胞系的基因表達[3-4]。隨後， Jamey Marth博士實驗室的研究人員也證明了，Cre-Lox重組可以用在特定的轉基因動物T細胞中，以高效率的方式刪除loxp兩側的DNA序列[5]。

Cre重組酶

1981年從P1噬菌體中發現(有些文獻中也稱為「環化重組酶」)，由343個氨基酸組成的38kDa蛋白，有4個亞基和2個域:較大的羧基(C端)域和較小的氨基(N端)域。是一種位點特異性的DNA重組酶，能特異識別loxp位點，介導loxp位點間的序列刪除或重組。

loxP位點

locus of X-over P1來源於噬菌體P1，是一段長度為34bp的DNA序列，包括兩個13bp的反向重複序列和一個不對稱的8bp間隔區組成。反向重複序列是Cre重組酶的特異識別位點，而間隔區域決定了loxP位點的方向。

13bp 8bp 13bp

ATAACTTCGTATA - NNNTANNN -TATACGAAGTTAT

（N 表示鹼基可能發生變化）

Cre-loxP重組酶系統的作用方式

Cre重組酶識別loxP位點兩端的反向重複序列並結合形成二聚體，然後此二聚體與另一個loxP位點上的二聚體結合形成一個四聚體。LoxP位點是有方向性的，四聚體連接的兩個位點在方向上是平行的。然後兩個loxP位點間的DNA序列被Cre重組酶切斷。接著，DNA連接酶快速高效地將這些鏈連接起來。重組的結果取決於loxP位點的位置和方向。

主要會發生以下三種情況：

1、 如果兩個loxP位點位於同一條DNA鏈上且方向相同，Cre重組酶介導loxP間的序列切除；

2、如果兩個loxP位點位於同一條DNA鏈上且方向相反，Cre重組酶介導loxP間的序列反轉；

3、如果兩個loxP位點位於不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶介導兩條DNA鏈發生交換或染色體易位。

然而，另需要注意的是，A、B、C三種情況也有可能會發生逆轉，可以通過引入兩對不同的loxP位點，經過兩組loxP位點的兩輪重組即可達到一種穩定狀態。在基因編輯動物中，最常用的是A、B兩種情況，這兩種基因編輯方式也可以簡單的概括為「正向刪除，反向反轉」。

Cre-loxP重組酶系統的優點

1、時空特異性

除了實現目的基因在特定組織（比如利用組織特異性表達啟動子+Cre）中的改造外，還可以可以實現目的基因在特定時間（比如在Cre後加ERT2）的改造，那ERT2是什麼？怎麼實現在特定時間的調控呢？（預知後事如何，且聽下回分解！）

2、高效性

《基因打靶技術》一書中闡述過兩個loxP之間的距離在1.5-3.5kb之間時，敲除效率可到99%，這也只是經驗值，目前很多研究都可以敲除更長的片段！

3、應用範圍廣

真核及原核均適用，不同組織、不同生理條件性均可起作用。

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Cre工具大鼠

參考文獻

[1] genome.gov/12514551/

[2] scq.ubc.ca/targeting-yo

[3] Sauer, B. Functional expression of the Cre-Lox site-specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 1987, 7(6): 2087–2096.

[4] Sauer B, Henderson N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988, 85(14): 5166–5170.

[5] Orban P C, Chui D, Marth J D. Tissue– and site–specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992, 89(15): 6861–6865.

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