介紹

KRAS 突變在人類癌症中廣泛流行（ Bos，1989）。的錯義突變的KRAS在密碼子12中異常激活蛋白通過衰減其成過度興奮狀態 GTP酶的活性，導致GTP結合活化的KRAS（的附著物利托等人，2016，Patricelli等人，2016，Pylayeva-Gupta等人。，2011）和下游信號通路的激活（Downward，2003）。KRAS p.G12C 突變在NSCLC中佔優勢，包括11％-16％的肺腺癌（45％-50％的突變 KRAS是p.G12C）（Campbell等，2016，Jordan等，2017），以及1％-4％分別為胰腺癌和結腸直腸腺癌（Bailey等，2016，Giannakis等，2016）。

儘管存在這種普遍性，但儘管經過數十年的廣泛努力，突變體 KRAS仍然是一個棘手的治療靶點（Cox等，2014）。已經嘗試了各種虛擬的，高通量的和基於片段的篩選策略來鑒定靶向KRAS的小分子。所追求的策略包括破壞開關-I（aa 30-38）和開關-II（aa 59-76）區域的活性狀態構象，促進鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEF）相互作用（Burns等，2014，Evelyn等。 。，2014，Leshchiner等，2015，Maurer等，2012，Patgiri等，2011， Sun等，2012 Welsch等，2017 ），或靶向核苷酸結合位點（Lim et al。，2014，Xiong） et al。，2016 ）和相鄰的淺表面袋，其中包括最近發現的開關II環區域（S-IIP）下的變構袋（Ostrem等，2013），也在Ostrem和Shokat（2016）中進行了總結。和效應器綁定（Shima et al。，2013)

雖然許多這些創新方法證明瞭RAS上以前未知的結合口袋，但它們僅導致了對細胞中KRAS的足夠靶標抑制的有限證明，並且所有這些都嚴重缺乏體內反應的證明，並且具有令人信服的靶向作用機制的證據。由於缺乏在體內抑制KRAS的藥理學工具，社區留下了工程系統和RNAi靶向方法來詢問KRAS 成癮和突變KRAS 依賴性 體內。這些挑戰與針對KRAS的可行療法的臨牀未滿足需求相結合，促使我們基於結構的藥物設計改善突變體定向和KRAS特異性抑製劑的效力和藥物樣特性。

我們和其他人先前描述了一系列S-IIP G12C KRAS抑製劑，它們與KRAS G12C的GDP結合狀態結合併共價反應，使其處於無活性構象（Lito等，2016，Patricelli等，2016））。使用ARS-853（和類似物），兩組都報告了KRAS-GTP的顯著消耗，其對應於細胞中KRAS G12C的Cys-12的共價佔據，以及下游RAS信號傳導抑制。兩份報告一起提供了KRAS G12C的證據確實循環的核苷酸的在細胞中的狀態，使得其無活性的GDP結合狀態可以隔離KRAS並耗盡活性構象。這些研究仍然存在一個嚴重懸而未決的問題，即為治療潛力鋪平道路 - 它是否有效在體內作用嗎？

由於針對僅在GDP結合的無活性狀態下可獲得的S-IIP的固有機制限制，這種方法是否在體內起作用存在很大的不確定性。雖然我們之前報道過細胞中KRAS核苷酸結合狀態的快速循環可以在KRAS G12C 抑製劑持續暴露於細胞培養物中的情況下允許接近完全的KRAS參與，但不知道在有限的暴露窗口內體內參與的程度是多少。共價抑製劑可以從循環到其GTP活性構象捕獲足夠的KRAS-GDP 。要解決這個問題，有兩個主要障礙。首先，抑製劑必須具有高效力和快速結合動力學變構地捕獲經歷快速核苷酸循環的KRAS G12C 的GDP結合的無活性狀態。第二個障礙是優化葯代動力學（PK）特性以維持足夠的暴露和持續時間以驅動 GDP結合狀態的近乎完全的共價靶標參與。為此，KRAS G12C抑製劑需要在體內表現出ADME屬性的有利平衡穩定性和目標反應性方面以便最大限度地減少對血液中常見的混雜親核試劑（血漿蛋白）的非特異性反應（ Strelow，2017）。儘管這種理想的PK方案對所有具有反應性彈頭的共價抑製劑提出了挑戰，但是S-IIP靶向方法將要求將抑製劑的暴露維持在閾值濃度以上足夠的持續時間，以最大化捕獲從該循環中循環的GDP狀態。 GTP結合多數體內。目前尚不清楚克服這些體內概念驗證的挑戰是否可行。

在這裡，我們報告了一類S-IIP G12C抑製劑的設計和表徵，其具有改進的效力和藥理學性質，克服了最初ARS-853系列的侷限性。我們描述了化合物ARS-1620，其具有實現足夠的體內共價靶佔據以抑制腫瘤中KRAS-GTP 所必需的特徵。我們提供了對p.G12C KRAS 突變細胞系和體內腫瘤模型中ARS-1620的共價和突變等位基因特異性精確度的概念和機制支持的證據。該努力驗證突變體KRAS是KRAS G12C的中心致癌驅動 突變腫瘤模型因子，為靶向KRAS的S-IIP提供了支持，作為一種可行的治療策略。p.G12C KRAS突變癌症，代表了將KRAS抑製劑帶入臨牀的重要一步。

結果

設計Switch-II口袋KRAS G12C抑製劑具有改善的效力和類似藥物的特性對於優化先前報道的S-IIP KRAS G12C 抑製劑的效力和藥理學性質存在主要的化學挑戰。為了說明這一點，我們在ARS-853系列中合成了許多類似物，並總結了它們具有特定藥理學特徵的生化/細胞靶活性。使用液相色譜 - 串聯質譜（LC / MS-MS）為基礎的測定（Patricelli等，2016）直接和定量測量KRAS的Cys-12上的化合物共價加合物形成，我們報告了最有效的化合物（ARS- 853）修改KRAS，平均生化和細胞速率常數（k obs / [I]）為140-150 M -1 s -1。該系列的一個主要缺點是在短的代謝穩定性等離子體（噸1/2 <20分鐘），並口服差的生物利用度在小鼠（F <2％），使得不可行的進一步體內勘探（圖1的A）。

狹窄的結構活動關係（SAR）限制了ARS-853系列進一步提高效力。此外，該系列核心支架內的鄰氨基酚部分和甘氨酸接頭是代謝熱點和血漿穩定性差和ADME / PK負擔的來源（Stepan等，2011 ）。因此，我們改變了我們的重點，設計結構不同的支架是適當定位的構象和丙烯醯胺彈頭的軌跡，並允許在S-IIP內適當放置疏水結合部分的最佳距離。我們假設ARS-853系列的柔性2-氨基-1-（哌嗪-1-基）乙烷-1-酮接頭可以縮短並用更剛性的雙環支架代替並適合S-之間的未佔據區域。 II和α3螺旋由我們先前報道的ARS-853共晶結構揭示（Patricelli等，2016 ）。在廣泛的支架優化後，我們確定了一種喹唑啉核心作為多功能的鉛支架，可以克服ARS-853的SAR限制並具有更好的藥物樣特性（圖1B）。這一進步導致了基於喹唑啉的系列（Li et al。，2015並且在系統優化支架周圍的取代基後，導致KRAS共價結合活性的顯著改善和有利的ADME / PK 潛力（圖 1C）。ARS-1620 在p.G12C突變癌細胞中共價抑制KRAS G12C活性，具有高效力和阻轉異構選擇性

從喹唑啉系列合成了幾種具有改善活性的化合物。在頂部命中中的是化合物ARS-1620，其含有氟苯酚疏水性結合部分，其具有軸向手性，使得S-對映異構體對於KRAS的Cys-12具有阻轉異構反應性（圖 2A ）。與KRAS G12C結合的ARS-1620的共晶結構揭示了從最初的S-IIP KRAS G12C 抑製劑到達Cys-12的獨特結合模式和軌跡，並揭示了與His-95的額外和關鍵相互作用的獲得導致更多與ARS-853系列中的化合物相比，共價反應具有剛性和有利的構象（圖2 -2D;表S1）。在生化分析中證實了ARS-1620從先前化合物修飾KRAS的效力的改善，其中ARS-1620共價修飾KRAS G12C，觀察到的速率為1,100±200 M -1 s -1（k obs / [I]），比ARS-853提高了10倍。的R-構象阻轉異構體是近1000倍ARS-1620效力較低（1.2±0.6M的-1小號-1），並因此用作一個獨特非激活控制化合物（圖2 E）。兩種阻轉異構體的立體動力學是構象穩定的，並且缺乏任何可檢測的相互轉化（見 STAR方法））。阻轉異構體之間的顯著選擇性在結構上通過氟苯酚部分的構象取向來解釋，其中活性S-對映異構體（ARS-1620）上的羥基佔據溶劑化區域並且形成多個水介導的與KRAS殘基的氫鍵而氟化物組佔據疏水區域（圖 2C）。與其他S-IIP KRAS G12C抑製劑作用模式一致（Ostrem等，2013，Patricelli等，2016 ），ARS-1620優先參與KRAS G12C 的GDP核苷酸結合狀態，並且對任何殘基都沒有可檢測的反應性。野生型（WT）-KRAS蛋白質（圖2E）。此外，與ARS-1620共價結合的KRASG12C缺乏SOS-和EDTA介導的核苷酸交換能力，這與先前報道的KRASG12C陷入GDP結合的無活性狀態的捕獲機制一致（圖2F和 S1）（Lito等， 2016，Ostrem等，2013，Patricelli等，2016）。

我們接下來評估了攜帶突變等位基因的一組細胞系（n = 4）中KRAS G12C 的ARS-1620共價修飾的效力和動力學。ARS-1620以濃度和時間依賴性方式快速參與G12C，與其共價抑制機制一致（圖3A）。處理2小時後，ARS-1620在?0.3μM時表現出半最大G12C靶接合（TE 50）並且在3.0μM時接近完全接合。相比之下，R-對映異構體缺乏任何相關的目標佔有率。細胞接合動力學 Patricelli等，2016 ARS-1620的與先前報道的全局擬合模型參數非常匹配（）描述了在動力學模型的背景下觀察到的ARS-853的參與率，該動力學模型結合了實驗確定的基線GDP / GTP結合的KRAS G12C 和核苷酸循環速率（圖S2）。

為了確定KRAS特異性抑制對RAS途徑激活的影響，我們在用ARS-治療24小時後評估了缺乏p.G12C（A549，H460和H441）的H358（p.G12C ）和陰性對照肺癌 細胞。 1620，無活性的R- 阻轉異構體和ARS-1620的飽和丙烯醯胺類似物，其不能與半胱氨酸形成共價鍵。與G12C靶向結合一致，ARS-1620 在H358中以劑量依賴性和選擇性方式抑制RAS-GTP（RAF-RBD下拉親和力）和MEK，ERK，RSK，S6和AKT的磷酸化，但不在陰性對照細胞系中（圖3 B）。在對比中，非活性? -atropisomer和飽和的（非共價）的類似物缺乏關於RAS信令在所有測試化合物濃度（μM≥10）任何可觀察到的效果。我們接下來比較了ARS-1620對ARS-853抑制RAS信號傳導的活性，發現ARS-1620表現出> 10倍效力改善（120 nM IC 50對1,700 nM IC 50 ），與G12C佔有率一致，產量> 100 細胞中突變等位基因選擇性的倍數窗口（ 圖3和S3A）。

我們接下來監測RAS途徑抑制的動力學，所述RAS途徑抑制在治療的急性（0.5至6小時）和長期時程（至多48小時）內。ARS-1620對RAS信號傳導的影響與G12C靶標參與緊密匹配，並且與RBD下拉後抑制RAS-GTP和KRAS-GTP（分別使用pan-RAS同種型或KRAS-同種型選擇性抗體）一致。該觀察結果與KRAS G12C的特異性一致，並且得到基於LC / MS-MS的證據支持（Patricelli等，2016），突變KRAS是RBD下拉分數中主要的（> 95％）GTP活性同種型。p.G12C 突變癌細胞（圖S3B-S3D）。RAS-GTP抑制的耐久性在長達48小時的治療期內保持不變（圖S3E ）。這進一步得到G1細胞週期停滯（圖S3F-S3H）的支持，並且在用ARS-1620處理的p.G12C 突變細胞中顯著增加細胞凋亡誘導（圖 S3F，S3I和S3J）。

為了評估對抑制細胞生長的影響，我們在一組攜帶KRAS p.G12C（H358，MIA-PaCa2和LU65）或其他突變體的癌細胞系中分析了ARS-1620，R- 阻轉異構體和飽和類似物。KRAS 等位基因（H441，A549和HCT116）在5天的治療期內。ARS-1620表現出對p.G12C細胞系（150nM IC 50）的完全生長抑制，對對照細胞系具有相對良性的作用。此外，R-對映異構體和飽和類似物對高達10μM化合物濃度的生長抑制沒有任何顯著影響（圖3 C）。此外，ARS-1620的抑制作用可以與KRAS的誘導型表達被營救G12V（圖3 d和S3 K）並且是選擇性的KRAS G12C異位表達的Ras-以下的MEF但不WT，G12D，或G12V KRAS等位基因（圖3 E）。總之，這些數據證明ARS-1620誘發亞微摩爾的等位基因特異性的效力（IC 50 ≤0.3μM; IC 90 ≤1μM）和強烈支持ARS-1620的活性是特定於G12C等位基因和由共價修飾介導的Cys-12。針對具有突變等位基因特異性精確度的致癌驅動因子

共價抑製劑的主要風險是與脫靶蛋白非特異性反應的可能性。在ATP口袋附近有約200種具有反應性半胱氨酸的激酶（Liu等人，2013），並且同樣延伸至具有反應性半胱氨酸的非激酶蛋白質（Strelow，2017），如果靶向可能產生不想要的特異性毒性。為了更好地定義ARS-1620的可能的脫靶責任和特異性，我們使用無偏的化學蛋白質組學篩選評估細胞內共價反應性，其解析度覆蓋8,501個半胱氨酸橫跨3,012個注釋蛋白質的殘基。在用ARS-1620處理4小時後，我們鑒定出KRAS的Cys-12是蛋白質組中最基本且顯著參與的半胱氨酸（p = 1.15×10 -5）（圖4A）。這與針對G12C的Cys-12胰蛋白酶肽和接近飽和度的動力學結果一致（圖3A和S2）並且涵蓋抑制下游RAS信號傳導抑制所需的濃度和時間（圖3B和 S3））在之前的實驗中。ARS-1620還修飾了FAM213A和AHR的半胱氨酸，它們是使用丙烯醯胺彈頭的共價化合物（包括臨牀批准的）的常見目標（Lanning等，2014）。為了進一步理解ARS-1620的潛在的脫靶負債，我們異形的半胱氨酸選擇性? -atropisomer缺乏KRAS的Cys-12的反應性，結果發現，這兩個旋轉異構體顯示出朝向FAM213A和AHR（相似的反應性。圖4的B）。這些數據證實了ARS-1620的Cys-12等位基因特異性KRAS靶標譜，並支持平行使用R-對映異構體作為獨特的化學對照，以排除下游評估中可能的脫靶活性。

我們接下來採用轉錄組分析策略來闡明致癌KRAS網路的組分並揭示與ARS-1620 的功能選擇性相關的任何相關基因轉錄關係。為瞭解決這個問題，我們比較了ARS-1620或DMSO處理的H358細胞和穩定表達pLKO.1熒光素酶對照或 KRAS 小髮夾RNA（shRNA）的H358細胞的全基因組基因表達譜（敲低[KD]） 。聚類分析揭示了ARS-1620處理的和表達KRAS shRNA的KD細胞（KRAS-KD）之間的相似性。4,988個基因 與它們各自的對照相比，在ARS-1620處理的細胞和KRAS-KD細胞中差異表達（圖4C）。觀察到三個不同的差異調節基因簇。具有顯著下調的最大簇包括KRAS調節的網路，其富含與致癌KRAS 轉化相關的基因（Barbie等人，2009，Chiaradonna等人，2006，Liberzon等人，2015 ），例如E2F轉錄因子（Liberzon等，2015 ），MYC 監管網路（Bild等，2006 ），ERK激活（Dry et al。，2010，Kwong等人，2015）和KRAS依賴性簽名（Singh等人，2009，Sweet-Cordero等人，2005，Vallejo等人，2017）來自策劃的體外實驗系統沉默KRAS和分類的腫瘤類型患者由KRAS 基因型（圖4 d，S4 A，和S4B; 表S2）。

為了進一步研究RAS途徑調節的基因，我們將比較擴展到用ARS-1620處理後H358和LU65（p.G12C ）與非G12C KRAS 突變細胞（A549）的表達譜。2,820個基因差異表達並與KRAS 敲低，trametinib和ARS-1620處理的細胞重疊，185個基因重疊，具有最大顯著性（> 2絕對log 2 倍變化，錯誤發現率 [FDR] q <0.01）（圖 S4C和S4D; 表S3）。使用策劃的KRAS依賴性基因組（23個基因），我們發現ARS-1620顯著降低了基因組的表達p.G12C突變細胞以時間依賴性方式但不在p.G12S中突變細胞中（圖S4D-S4F）。在ARS-1620中顯著獨特且未被KRAS-KD細胞調節的ARS-1620調節基因中，涉及異生物質代謝，CYP誘導（例如，P450酶）和氧化還原氧化/還原型過程（圖4 C，4D和S4 G）並且可能與共價抑製劑的細胞藥理學相關。總的來說，這些基因表達關係通過抑制KRAS G12C 下游的致癌網路來建立分子相關性並進一步支持ARS-1620。ARS-1620通過靶向作用機制誘導腫瘤消退

已經證明開發具有足夠藥理學性質的RAS活性的治療劑很難實現。通過基於結構的喹唑啉支架的設計優化，我們能夠充分地實現合理的藥物樣特性，同時保持細胞中的效力和共價動力學（圖5A ）。ARS-1620 在小鼠中表現出優異的口服生物利用度（F> 60％）和足夠的血液穩定性，這對於體內G12C靶標佔有率的定量測量是必需的。儘管儘管化學系列的GDP結合核苷酸狀態偏好仍在細胞中實現G12C的快速參與，但是仍然不知道是否有足夠的共價動力學和葯代動力學可以滿足S-IIP G12C靶向方法在體內獲得成功的特性。為瞭解決ARS-1620是否具有引發體內靶標佔據的能力，我們在具有KRAS p.G12C的已建立的皮下異種移植模型中口服施用ARS-1620 。在單次口服劑量或連續5次每日劑量後，ARS-1620分別產生1.5μM（50 mg / kg）和5.5μM （200 mg / kg）的平均峯值腫瘤濃度，從而實現了顯著的KRAS G12C目標佔用率（≥70） ％G12C-TE在200毫克/千克）> 24小時（圖5 B和S5 A）。在這些暴露中，ARS-1620引起劑量和時間依賴性抑制的RAS-GTP，在MIA-PaCa2和H358異種移植物的共價帶修飾G12C跟蹤以下一個單次劑量（圖5 C， S5 B，和S5C）。目標覆蓋範圍也擴展到ARS-1620（200 mg / kg）連續3天的每日劑量時間表，提供顯著的G12C目標佔用率（75％至90％G12C-TE）以及RAS-GTP和下游信號抑制（圖5D）。

如果達到的目標佔有率可以轉化為體內抗腫瘤活性，我們接下來解決。為了證明這一點，我們在攜帶KRAS p.G12C或p.G12V的已建立的皮下異種移植模型中口服施用ARS-1620 。在MIA-PaCa2異種移植物（p.G12C ）中，ARS-1620以劑量依賴性方式顯著抑制腫瘤生長（p <0.001），以200mg / kg 的劑量顯著消退，每日一次（圖5E，左）面板）。

H441（p.G12V）的異種移植物在所有測試劑量下都沒有反應（圖5E，右圖）和R -ARS-1620的阻轉異構體在兩種模型中均缺乏活性，證明瞭該反應的特異性。治療3周後，腫瘤中AR12-1620的G12C靶標佔據足以引起深刻的RAS-GTP和下游信號傳導抑制。具有一致的體外觀察，- [R -atropisomer表現出可以忽略不計G12C目標佔用和缺乏關於RAS途徑活化（效果圖5 F和S5 d）。KRAS依賴性的系統評估揭示體外和體內腫瘤模型之間對KRAS抑制的差異敏感性

在確定ARS-1620 以等位基因特異性精確度引發體內抗腫瘤活性後，我們接下來試圖研究p.G12C 癌症模型對突變體KRAS的廣泛依賴性。大量報道觀察到 KRAS突變癌細胞系中持續KRAS表達（<50％成癮）的異質依賴性（Hayes等，2016，Kapoor等，2014，Lamba等，2014，Patricelli等，2016），Shao等，2014，Singh等，2009，Sunaga等，2011，Vartanian等，2013 ），例如，一個大規模的RNAi稱為Project DRIVE（屏幕McDonald等。，2017 ）報道KRAS 獨立以下的shRNA敲倒KRAS中通常使用的KRAS突變體的模型，包括那些窩藏p.G12C。如果只有少數KRAS突變癌實際上依賴於KRAS作為致癌驅動因素，這將對G12C靶向策略的治療可行性產生深遠影響。因此，我們系統地研究並組裝了一組KRAS p.G12C癌細胞系（n = 15）並比較了它們從體外培養系統到體內的KRAS依賴關係。 使用ARS-1620作為藥理學工具的腫瘤異種移植模型。

我們 在體外篩選中直接比較了單層（2D粘附）和3D超低粘附（ULA）懸浮球體培養物以排除細胞粘附的可能性減弱對ARS-1620的敏感性 - 類似於影響KRAS突變體的培養物粘附的報道細胞向KRAS敲低（ Fujita-Sato等，2015， Patricelli等，2016， Vartanian等，2013 ）。經過5天的治療期後，在單層培養條件下，只有少數G12C突變細胞系對ARS-1620敏感（圖6）A，頂部面板），而在3D球體條件下，ARS-1620引起強烈響應（p = 0.0140）（圖6A，下圖）。在兩種培養設置中，非G12C細胞系在高達10μM的化合物濃度下缺乏任何顯著效果。比較來自Project DRIVE RNAi屏幕的KRAS依賴性敏感性評分（ATARiS）（McDonald等，2017）提供了與ARS-1620靈敏度的中等準確關聯作為2D貼壁單層，這是用於Project DRIVE屏幕的格式。總之，這些數據證實了不同培養系統中KRAS依賴性的固有差異。

為了建立與該觀察結果的體內相關性，我們接下來詢問ARS-1620是否會引起體內反應，該反應跟蹤體外觀察到的可變靈敏度。為瞭解決這個問題，我們分析了NSCLC細胞系異種移植模型（n = 5）的反應，其中5個中的4個預計對基於2D生長反應的治療完全無效，而從3D，預期體內反應要敏感（圖6A ）。治療2至3周後，所有5個NSCLC模型均有反應（> 70％腫瘤生長抑制[TGI]），5個模型中有4個顯示出顯著的腫瘤生長抑制（p <0.01），並且腫瘤消退顯著> 50 ％的動物（圖 6B）。值得注意的是H2030，H1373和HCC44異種移植物的響應，因為作為3D球體的體外響應> 20×作為單層的響應（~0.3μM3D-IC 50對比~5.5μM的2D-IC 50）。這些發現強化了對3D球體系統最好地預測KRAS G12C指導治療的體內抗腫瘤反應程度的支持。這些結果還意味著從體外單層培養系統推斷體內KRAS 成癮的謹慎感。ARS-1620在PDX腫瘤模型中顯示出有效和選擇性的抗腫瘤活性

為了進一步證明ARS-1620的治療效果，我們在一組攜帶KRAS p.G12C（n = 4）的患者衍生（PDX）腫瘤異種移植模型中比較了缺乏突變等位基因的PDX模型中的抗腫瘤反應（n = 3）（對於靶向測序結果，也參見表S4 ）。所述p.G12C PDX面板包括三個非小細胞肺癌腺癌，這是一個潛在的目標指示與最大頻率KRAS p.G12C 突變的患者（（11％-16％）Campbell等人，2016，Jordan等人，2017年和胰腺癌代表少部分（<2％）的KRAS突變胰腺癌（Bailey等，2016） ）。使用每日200mg / kg方案治療3周後，ARS-1620在p.G12C PDX模型中誘導顯著的TGI（p <0.001）和顯著消退，而攜帶非G12C的異種移植物缺乏任何應答（圖7A）。我們在研究使用每日200毫克/公斤的治療方案（（6小時後最後一次劑量）的端部上確認腫瘤ARS-1620的平均≥75％G12C目標佔用圖7的B）。此外，ARS-1620顯著抑制P-ERK和P-S6在整個p.G12C PDX模型（P <0.05）（圖7 C，S6 A，和S6B）。通過免疫組織化學監測，這導致顯著的凋亡誘導（p = 0.0148）裂解的胱天蛋白酶-3的（IHC）染色（圖7D）。我們接下來評估了以更高劑量或頻率施用的ARS-1620是否可以改善荷瘤動物的靶標佔有率和功效。既為200mg / kg，每天兩次（BID）或400mg / kg的每日一次ARS-1620的時間表提供改進的響應率在 p.G12C PDX模型（圖7 A）和用更強的對ERK抑制相關（圖S6甲-S6C），與在細胞系衍生的異種移植模型中觀察到的更大的G12C佔據一致（圖 S5E-S5H）。在所有使用的腫瘤模型中，ARS-1620在整個3周治療期間耐受良好（圖S6D和S6E）。此外，即使在7天的時間內每天口服劑量高達1,000mg / kg，也沒有觀察到ARS-1620在CD-1小鼠中的臨牀體徵或毒性（參見STAR方法中的動物研究）。高於400mg / kg，ARS-1620表現出PK飽和，因此在細胞系衍生的和PDX衍生的模型中沒有實現抗腫瘤功效的進一步增強（數據未顯示）。總之，ARS-1620通常具有良好的耐受性，並且在小鼠中未達到最大耐受劑量（MTD）。總的來說，ARS-1620在各種KRAS G12C小鼠癌症模型中的體內功效和突變體選擇性觀察支持將來共價靶向KRAS的S-IIP的治療策略。

討論

儘管數十年的研究強調突變體 KRAS是腫瘤發生和臨牀抗性的中心驅動因素，但直接靶向突變體 KRAS 的治療劑的開發迄今尚未完成。KRAS上缺乏明顯的可藥物袋足夠大以至於小分子結合對治療靶向施加了廣泛的挑戰。已經在KRAS（ Maurer等人，2012，Ostrem等人，2013 ）上鑒定了除了核苷酸結合位點之外的淺口袋和基於片段的配體，但沒有一個已經導致鑒定具有合適效力的抑製劑。目前，所有報道都很小KRAS的分子結合物在生物化學上很弱，並且顯示微摩爾活性，需要對治療用途進行實質性改進。因此，提高直接KRAS抑製劑的效力是一個主要的化學挑戰，特別是在具有高動態和誘導擬合構象變化的口袋中，例如S-IIP。

在報道的小分子KRAS結合物類別中，很少有人確認在生物化學和細胞環境中的靶向分子作用機制。雖然最近關於RAS同種型的小分子結合物的報道已經描述了體外和體內模型的活性（Athuluri-Divakar等，2016，Welsch等，2017），但生化結合所需的濃度之間存在很大差異。 RAS（高微摩爾）和引發細胞和體內活動以排除靶向和RAS定向作用機制所需的那些。在對比中，S-IIP類共價KRAS的G12C抑製劑（利托等人，2016，Ostrem等人，2013，Patricelli等人，2016 ），儘管它們的初始缺乏效力，可產生對突變體非常具體且令人信服目標效果等位基因在細胞。該系列中最先進的抑製劑ARS-853在細胞的低微摩爾範圍內具有改善的效力（ Patricelli等，2016 ），但該系列固有的不良化學和代謝穩定性使其不適合使用在動物模型中（見圖 1A）。

由於缺乏用於評估體內直接靶向突變體KRAS的抗腫瘤活性的藥理學工具，仍然不知道用小分子抑製劑直接靶向KRAS是否在治療上是有效和可行的。為瞭解決S-IIP靶向策略在體內工作所面臨的主要挑戰，必須克服重大障礙：與G12C共價結合的速度必須足以在腫瘤內快速循環中獲得GDP限制狀態，抑製劑必須平衡這種最佳效力和選擇性與有利的PK曲線。該報告將ARS-1620描述為直接KRAS G12C小分子抑製劑的第一個例子，該抑製劑具有強效，選擇性，口服生物可利用性，並且對體外和體內 KRAS G12C的 全面和深入研究具有良好的耐受性。儘管機械特異性結合了GDP結合形式的突變體KRAS，但ARS-1620 在單次口服劑量捕獲突變體處於無活性狀態後保持足夠的PK以在體內參與G12C 。因此，該發現擴展了我們對KRAS G12C 快速核苷酸循環至體內人癌細胞的體外觀察 線和患者來源的腫瘤模型。回想起來，實現高共價效力和足夠高且持久的暴露以捕獲GDP結合狀態的組合已成為S-IIP靶向策略的藥物設計的最大障礙，其包含數百個合成候選物。儘管存在這一挑戰，但值得注意的是，ARS-1620體內PK形態和體內鍵形成共價率使得在所用劑量下長時間保持≥75％的目標佔用率，並且數據顯示這種佔用程度在腫瘤模型中達到治療效果是必要和充分的。我們設想的策略是最大化體內 G12C靶標佔用率將是一個重要的特性，在進入臨牀時使用開發這類化合物。我們必須考慮的另一個治療考慮因素是KRAS G12C 在體內循環核苷酸 的結果; 因此，有可能通過與上游RTK抑製劑（例如EGFR）的合理靶向組合來促進化合物與G12C的結合，其通過改變細胞KRAS結合的GDP / GTP比率而有利於KRAS G12C的GDP結合狀態的可及性。 KRAS G12C- GDP，體外用ARS-853證實（ Lito等，2016，Patricelli等，2016））。利用共價和不可逆機制的創新治療方案也可以揭示最大化G12C佔有率的策略，以達到針對該目標方法的最大治療效果。鑒於KRAS G12C 抑製劑對突變等位基因的高靶向選擇性，我們預計這將轉化為更少的副作用和更高的體內耐受性。實際上，ARS-1620在小鼠中具有良好的耐受性，因為尚未達到MTD。總的來說，ARS-1620代表了一類新的直接KRAS抑製劑，其在候選藥物範圍內具有體外至體內效力和治療窗口。

由於缺乏藥理學工具，KRAS對體內KRAS突變癌症的依賴性的強度和廣度仍未得到充分研究。基於RNAi的方法已經產生了許多使用KRAS突變癌細胞系和大規模 shRNA篩選對KRAS 沉默具有可變靈敏度的說法（ Hayes等，2016，Lamba等，2014，McDonald等，2017，Singh等）。 al。，2009，Sunaga等，2011，Vartanian等，2013）。對突變體KRAS持續表達的差異敏感性在粘附單層與3D培養設置下進行檢測時也得到了肯定（Fujita-Sato等，2015，Patricelli等，2016，Vartanian等，2013）。在本報告中，我們研究了KRAS p.G12C 癌細胞系中 KRAS的依賴性。利用ARS-1620作為藥理學工具，該研究系統地證明瞭體外系統和體內NSCLC腫瘤模型之間致癌KRAS依賴性的相關性。我們在研究中納入了G12C突變癌細胞，其對KRAS耗竭具有一定的敏感性，通過來自Project DRIVE靈敏度網路的薈萃分析證實了這一點（ McDonald等，2017 ）。使用該細胞系組，我們證實了ARAS-1620 體外KRAS抑制對 KRAS依賴性評分低和高的細胞系的差異敏感性，並且還證實了單層與3D球體之間KRAS依賴性的培養依賴性效應。我們現在可以將這些KRAS依賴關係擴展到體內環境。ARS-1620作為多種細胞系和患者來源的小鼠異種移植模型中的單一藥劑非常有效的發現強調了突變型KRAS 在體內促進癌症生長和存活的重要性。。此外，我們的研究結果不僅意味著3D球體培養更好地預測KRAS突變癌細胞對ARS-1620的體內敏感性，它們支持使用粘附單層細胞培養物評估KRAS依賴性的體外研究顯著低估了體內KRAS依賴性。這對於解釋KRAS 作為驅動致癌基因的體外合成致死關係具有顯著的轉化意義。雖然3D文化越來越受到重視，並被用於更好地模擬體內環境和對化療的反應（Selby等，2017））和其他治療靶點（如HER2和EGFR）（Ekert等，2014，Howes等，2014，Pickl和Ries，2009，Weigelt等，2010 ），我們不知道任何批准的腫瘤藥物該顯示差的2D和3D培養物基本如KRAS抑制之間的活動。在未來的KRAS G12C定向藥物臨牀試驗中患者的反應率將是使用3D培養物預測臨牀對治療反應的價值的極好測試。總體而言，ARS-1620作為NSCLC模型中單一藥物廣泛有效的體內證據提供了概念證據，即p.G12C KRAS 突變的大部分患者可能受益於KRAS G12C指導的治療。我們的研究提供了第一個體內證據，證明S-IIP靶向方法可能是KRAS p.G12C突變型癌症患者的一種有前途的治療策略。

我們感謝K. Shokat和N. Rosen的討論和修改論文。我們感謝A. Borum化學管理和化學技術援助。我們感謝N. Khanna提供技術支持和共享試劑。我們感謝Shanghai Langtze Biomedical Technology的化學支持。我們感謝NCI提供了這項工作中使用的MEF。這項工作使用了高級光源（光束線5.0.3）的資源，該光源是合同DE-AC02-05CH11231 的DOE科學用戶設施辦公室。

作者貢獻

MRJ和劉毅寫了這篇論文。L.-SL擔任項目負責人，設計並監督化學。MRJ，L.-SL，JZ，MPP，PR和Yi Liu構思，設計和監督整個項目。MRJ設計，分析和監督體外實驗，腫瘤PD和IHC評估以及生物信息學。JZ設計，分析和監督體內實驗。LD監督藥理學實驗。RH構思並設計了質譜實驗。UP 在體外構思和設計生化實驗和晶體學。DH-L。和PPZ管理和監督該項目並編輯了論文。YC，AB，JHC，SJF，JMK，LVK，TE和DB進行體外實驗。XG，李雙偉和CT進行了體內實驗。Shisheng Li，KY，AZ，YW和YY進行了PK相關實驗。JF，YOL，Yuan Liu，TW和XD進行了化學合成。DB，DD和MVL有助於促進概念化，整體項目進展和修訂論文。

利益聲明

以下作者是Janssen Biotech的員工：DB，DD和MVL以下作者是Kura Oncology的員工：Yi Liu和PR 其餘的作者在此作為Wellspring Biosciences的員工完成了這項工作。Wellspring和Kura Oncology的作者也是Wellspring Biosciences母公司Araxes Pharma的股東。這項工作由Janssen Biotech在Wellspring Biosciences和Janssen Biotech的合作下進行了財務支持。與該工作有關的專利號：WO2015054572。

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