導讀

Trends in Cell Biology (Cell系列綜述, 2018 IF: 18.564）於2018年6月1日在線發表了Steven Boeynaems（PhD Biomedical sciences, Stanford University School of Medicine, 一作兼通訊）撰寫的關於蛋白質相位分離綜述一文《Protein Phase Separation: A New Phase in Cell Biology》。蛋白質相變做為細胞區室形成和調節生化反應的新思路而受到越來越多的關注，同時為神經退行性疾病中無膜細胞器生物合成和蛋白質聚集的研究提供了新的框架。該綜述中，總結了近年來無膜細胞器的研究現狀，相變的發生、發展、調控和在疾病治療中的應用進行了探討，並展望了未來幾年相變領域的主要問題和挑戰。內容豐富，見解前沿，值得相關領域的研究者細細品讀。

摘要

細胞區室和細胞器是組織生物物質的基本形式。大多數熟知的細胞器通過膜結構與周圍環境隔開。另外還有許多無膜結構的細胞器。最新研究表明這些無膜細胞器是蛋白質和RNA的超分子組裝體，通過相位分離形成。近來研究揭示了無膜細胞器的分子特性、形成、調節和功能。細胞生物學、生物物理學、物理化學、結構生物學和生物信息學的技術融合正幫助建立該新興領域–相變的分子調控原理，從而為找到治療與衰老相關疾病的新方法等重要發現鋪平道路。

Highlights

1. 相位分離在多種細胞過程中起作用，包括形成經典的無膜細胞器、信號複合物、細胞骨架和許多其他超分子組裝。
2. 相位分離的概念為理解序列簡併（低複雜性）和蛋白質無序區域的功能提供了新的研究方向。
3. 越來越多的證據表明，相變和無膜細胞器的失調在蛋白聚集相關的人類疾病中發揮關鍵作用。
4. 理解蛋白質相位分離背後的物理原理和分子互作機制可促進新型生物材料的研發。

名詞解釋

1. 凝膠 (Gel)：由大分子物質通過共價鍵（化學凝膠）或非共價鍵（物理凝膠）彼此連接構成的系統或液滴樣網狀結構。凝膠的物質屬性取決於分子間交聯的壽命、交聯的程度和模式 （交聯存在越久越傾向於固體，譯者注）。締合聚合物可形成物理凝膠，水溶性聚合物形成水凝膠。
2. 內部無序蛋白質/區域 (Intrinsically disordered protein/ region)：包含多種空間結構的蛋白質或在其自然狀態下構象可以快速變化的區域。（通常由重複序列或低複雜度序列組成，譯者注）
3. 液體 (Liquid)：物質的四個基本狀態之一，具有一定的體積但沒有固定的形狀。液體通常形成球形液滴使其表面積最小化以降低表面張力，且兩個液滴融合後仍為球形。在液體中，局部的空間秩序（主要是分子間距離和取向）不會超過鄰近幾個分子的尺寸，再遠一些的分子都是隨機組織。這導致液體結構可以實現快速重組並且還能夠與周圍環境進行成分交換。
4. 液晶 (Liquid–crystalline)：一種物質狀態，同時具有液體和晶體的雙重性質。組成液晶的分子以晶體樣形式組織，但也可以像液體一樣進行流動。液晶在分子尺度或至少在一個方向是有序的。液晶經常會隨著溫度的變化發生相變。
5. 液-液分層 (Liquid–liquid demixing)：兩種液體作為單獨的相共存而非混合溶液（參見相位分離）。
6. 低複雜性結構域（Low-complexity domain , LCD）：一種富含或僅由少數類型氨基酸組成的蛋白質片段。這些片段的組合通常遵循簡單模式，如串聯重複，並且與分子的快速進化速率相關。
7. 物質狀態 (Material state)：物質可以產生的物質狀態或相有四種：氣體、液體、固體和等離子體。
8. 無膜細胞器 (Membraneless organelle)：沒有膜結構限定的細胞區室。無膜細胞器通常由蛋白質和核酸組成，呈現多種物質狀態。
9. 相位分離 (Phase separation)：相位分離反映了一種去混合的狀態變化 (demixing transition)，其中均勻且充分混合的溶液重新排列，使得不同的空間區域被不同濃度的物質佔據。在最簡單情況如二元混合體系（聚合物和溶液）中，相位分離產生高濃度區域和低濃度區域。在Flory-Huggins溶解理論中，與二元混合物相關的混合自由能變數是二元物質的作用參數（interdispersing term , x，原文單詞，譯者根據弗洛裏－哈金斯溶液理論公式自主翻譯，參數x表示高分子和溶劑作用的參數）。如果物質不互溶比低（x <0），則自由能低，組分將形成均勻的充分混合的溶液。如果物質不互溶比高（x>0），則自由能高，會出現分層明顯的兩相。
10. 相變 (Phase transition)：雖然相位分離是指初始均相溶液的分層，但相變描述了分子的相位或狀態轉變（例如，從液體到固體）。
11. 固體 (Solid)：雖然液體和固體都被稱為凝聚態物質，但它們的組分組織方式和動力學係數不同。 無膜細胞器的物質狀態可以是結晶的，半結晶的或液晶的，這取決於其空間有序性的程度和空間排序的定向性偏好。

1 介紹

Introduction

真核細胞由許多隔室或細胞器組成。這些細胞器負責執行特定的生物學功能，對細胞組分、代謝過程和信號傳導途徑起時空控制作用。例如，細胞核從物理上把轉錄與翻譯分開，這使得真核生物形成原核生物中大部分不存在的一套複雜的轉錄後調控機制。其它有膜細胞器還有溶酶體，內質網和突觸小泡。然而，細胞內還有不少缺乏分界膜的細胞器，它們是由蛋白質、核酸及其他分子組成的超分子組裝體，如細胞核中的核仁、核斑點 (nuclear speckles)，以及細胞質中的應激顆粒stress granules (SGs)、加工小體（processing bodies，P-bodies）、中心粒 (centriole)。這些大部分胞體在幾十年前被發現，它們的結構也逐漸被解析。然而，關於這些胞體是如何形成的、為何形成、有著怎樣的生理特徵、如何促進生物功能等問題仍待探究。近年，跨學科研究手段的不斷進步，推動了對它們的組織，分子特性和分子機制的深入瞭解，以上問題也開始得到解答。隨著對驅動無膜細胞器形成的分子原理和理化動力的日益瞭解，可以更清晰闡明它們在各種細胞過程（如應激反應、基因表達調控和信號轉導）中的多種功能。在過去的幾年中，越來越多的證據表明無膜細胞器參與了衰老相關的疾病，如肌萎縮側索硬化症（ALS）。這些發現創造了細胞生物學的新領域——專註於探索細胞物質是如何組織成有特定功能的無膜細胞器以及它們的失調如何導致疾病的產生。

在這篇綜述中，我們探究了日漸火熱的無膜細胞器研究現狀，針對無膜細胞器相關的生物發生、組織結構、動力學及調節機制和功能提出了自己的見解，同時討論了最近該領域的研究結果如何幫助我們解析衰老相關的疾病的分子機制，這可以為基於相位分離開發新型治療策略奠定基礎。最後，展望了未來的主要挑戰以及未來幾年需要解決的問題。

2 無膜細胞器通過相位分離形成

Membraneless Organelles Are Formed via Phase Separation

許多無膜細胞質和細胞核區室例如，P-bodies，SGs (stress granules)，卵黃核 (the Balbiani body)，胚芽顆粒 (germ granules)，PML bodies，Cajal bodies，核斑點和核仁等已經研究了很長時間，然而，驅動它們形成的機制大多仍是未知的 (enigmatic,elusive 是比unknown更高規格來表示未知的詞，適合多用，譯者注，更多英語寫作見https://mp.weixin.qq.com/s/37dMnfA6RTSybzkzKnambw)。一些早期研究強調了這些組件組裝的動態特徵。在2005年，有學者認為Cajal bodies表現為「懸浮在半流體核質中的半流體球」，然而，缺乏關於這些組件的物理性質的確切實驗證據。2009年，Brangwynne，Jülicher和Hyman證明P顆粒 (Pgranules)（秀麗隱桿線蟲胚胎中含有RNA和蛋白質的胞體）具有類似液體的特性，並證明瞭它是通過相位分離形成。這是一種物理過程，過飽和的組分溶液自發分離成密相和稀相兩部分，然後穩定共存。P顆粒的類液體性質從它們的圓形外觀（使表面張力最小化的結果）、可變形性（熔合和裂變事件）及組分的動態交換等特徵中顯現出來的。在此後兩年，對核仁進行了類似的觀察。液體本身不是「簡單的液體」，而是一個具有特定含義的術語。「簡單液體」，也稱為範德華流體，包含通過各向同性短程電位相互作用形成的球形顆粒。蛋白質和RNA液相併不是均勻粘性的球形顆粒，它們更應被描述為締合聚合物，並且由這種體系形成的液體具有獨特的結構，這些結構由物理交聯形成，從而具備一整套材料特性，包括空間組織液滴的可能性，其中一種聚合物潤濕另一種聚合物。(Instead, they are best described as associative polymers and theliquids formed by such systems have distinctive structures that are defined byphysical crosslinks that give rise to a panoply of material properties,including the possibility of spatially organized droplets where one polymerwets another. 這一段不好翻譯，附上原文)

相位分離是聚合物化學中常見的現象，不過，它在生物大分子中的應用是近期纔出現的。前人研究發現，一些蛋白質（如血紅蛋白），濃度高時在體外會發生相位分離，但這些結果的意義並不是很清楚。特別是晶體學家在結晶試驗中經常觀察到液-液相位分離。液滴形成降低了成核的自由能，因此是結晶實驗中可預期的現象。然而，關於相位分離可能是控制無膜細胞器形成，調控生物功能和活性的認識是近幾年才產生的。Rosen及其同事在2012年就這一觀點提供了有力支持，他們發現含蛋白質和含RNA的結構可以從純化的成分中重建；並進一步提供了證據表明這些重構的液體胞體可以促進肌動蛋白聚合物的成核。在這些開創性發現之後的幾年中，人們逐漸認識到蛋白質和其他大分子（如RNA）可以形成充分混合或空間組織的凝聚物，並在不同的物質狀態之間切換。無膜細胞器通常被稱為生物分子縮合物，並且遵循與其他聚合物相同的物理原理（Box 1）。越來越多的數據支持這一過程中不同相變的多樣性以及背後複雜的分子和物理相互作用。

Box 1 方框1. 無膜細胞器可以是液體，固體或凝膠

無膜細胞器通常被稱為液體，但這種稱號會讓人聯想到熟知的液體而產生混淆。值得注意的是，所有液體，甚至是由硬球體構成的所謂簡單液體，都有明確定義的結構，並可以根據對關聯函數 (pair-correlation functions)進行量化。這些函數表明，液體在長度尺度上採用有序排列，而非晶體固體似的排列，其尺寸數量級為典型的分子尺寸。在較長的尺度上，分子是隨機組織的，其組織方式使人聯想到稀釋氣體。非球形分子具有空間和方向順序，水和其他分子液體（包括聚合物）也是。局部空間排序和分子間取向受不同空間幅度和方向的層級互作影響，例如遠程靜電，多極相互作用，氫鍵，力和涉及π（pi）-系統的短程相互作用。

在生物相位分離中，凝膠被認為是固體的同義詞，凝膠化被認為是從液體轉變為固體的過程。凝膠由分子間互作的系統網路形成，可以通過其組成型大分子的連通性來貫穿凝膠。如果凝膠具有長壽命的交聯和高密度的交聯，那麼材料性質可以與固體的性質一致。相反，具有短壽命交聯和/或低密度交聯的凝膠將具有類似於液體的材料特性。 實際上，細胞器可以是液體、某種形式的固體、液體凝膠、固體凝膠、結晶固體、半結晶固體或液晶，這取決於空間排序的程度和排序的方向偏好。 為了給無膜細胞器合理的描述，必須至少測量以下5個指標，即：（i）液滴中的大分子濃度，以量化密度；（ii）分子間長程空間排序的程度，以量化液滴內的分子間組織；（iii）分子間物理交聯的程度；（iv）液滴與其周圍環境之間的界面張力；（v）生成和破壞液滴內鍵的時間尺度。 理想情況下，以上5種測量方式將分別對體外模擬的液滴和體內活細胞中相同條件下的液滴進行檢測，以揭示體內外液滴的共性和差異。

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3 體內外蛋白質相位分離的分子決定因素

Molecular Determinants of Protein Phase Separation In Vitro and In Cells

蛋白質組學和遺傳學研究已經確定了幾種無膜細胞器的蛋白質成分，這些研究表明，蛋白結合結構域和/或線性基序 (adhesive domains and/or linear motifs) 的多價性 (multivalency)是驅動蛋白質（或RNA分子）相變的關鍵。多價性可以通過以下三種方式中至少一種來實現：（i）具有特定互作界面的摺疊蛋白質可以形成寡聚體，進而誘發相關元件的多價性 (associative patches)，並參與空間特異性互作; （ii）摺疊結構域可以通過柔性接頭連接在一起產生線性多價蛋白質; （iii）內部無序區域（IDRs）可以作為多個獨特的短線性基序的支架。當然，多價性也可以通過以上提到的三種方式組合或通過諸如無序區域內的結構形成等應激過程而出現。引起廣泛關注的一個特徵是驅動相變的蛋白質中存在IDRs(intrinsically disordered regions) 。無序區域的序列具有構象異質性（即無固定結構）被稱為內部無序蛋白質/區域（IDPs/ IDRs）。大多IDRs具有氨基酸組成偏好性且可能是重複序列，因此，這些IDRs的特定子集也稱為低複雜性域（LCDs）。富含IDRs / LCDs超分子組裝體的形成會促進不同性質的無膜細胞器的形成（圖1A-C）。一個典型的例子：IDRs、摺疊結構域和核酸之間不同分子相互作用產生了一系列組裝動力學特徵。例如，卵母細胞中的Balbiani bodies是由β摺疊相互作用結合在一的類固體狀蛋白質組裝；相反，許多RNA-蛋白（RNPs）顆粒是動態和類液體狀的，並且遺傳實驗已經證明IDRs有助於它們的組裝；已知RNA結合蛋白（RBPs）具有多價模塊結構域，在相位分離中的起著關鍵作用（Box 2）；通過柔性接頭連接的含有多個相互作用結構域的工程蛋白在與其特定靶標相互作用時表現出自發的液-液分層。這些數據表明，這種「fuzzy」作用模式可以實現多價互作功能域之間的多種組合，這可能是蛋白質相變的通用驅動因子（Box 3）。

（A.物質狀態和動態從液體到固體的廣泛變化； B. 蛋白質FUS （漸凍人相關疾病蛋白）在體外可以具有所有的形態； C. 無膜細胞器機器體外重建實例；D.幾個無膜細胞器展示。它們具有複雜的拓撲結構，包含可能屬於不同狀態的子隔室。生物AI插圖素材獲取和拼裝指導）

Box 2 方框2. 聚合物理論和多尺度模擬的見解

相變是一個協同轉換過程，涉及來自多價蛋白質間相互作用模塊的集體效應。這些多價蛋白可以進行凝膠化，從而形成物理交聯的系統網路，其中交聯是相關結構域/基序之間的非共價相互作用。蛋白質聚合物也可以通過密度轉變縮合，從而形成與稀相共存的緻密相。凝膠化的物理過程，更確切地說是溶膠-凝膠的轉變，已被用於相關功能域/結合基序的效價對相變驅動的影響。相比之下，密度轉變的物理特性解釋了形狀為球形的凝聚相的形成，並顯示出許多與液體相同的特性。實際上，兩種類型轉變的物理特徵協同作用共同促成了無膜細胞器的形成，即更熟知的生物分子縮合物的形成。

多價蛋白質是屬於締合聚合物的一類聚合物，它們可以通過相位分離或不經相位分離實現凝膠化。這裡，效價（valence）是指在分子內部和分子間相互作用時互作的功能域/基序的有效數量。最近對締合聚合物理論的計算機模擬和調整表明，多價蛋白質可以被解析成相關的結構域/基序，即所謂互作功能域（stickers, 粘著劑），並由間隔序列 (spacers)穿插。粘著劑能夠實現物理交聯，而間隔物 (spacers)或連接子 (linkers)決定是否通過相位分離驅動凝膠化。可溶性接頭或間隔物抑制相位分離，而自締合性或對溶解和結合無偏好的接頭/間隔物將通過相位分離膠凝化。從理論，模擬和最近的實驗中得出的關鍵結果發現，內部無序區域 (intrinsically disordered regions) (相變的決定因素)和液滴內蛋白質模塊的密度和組織形式，是推動相變的關鍵作用。

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除了僅用作連接子之外，IDRs還可以調節「粘性」互作以促進相變。 McKnight及其同事發現，隨著時間的推移，不同IDRs的濃縮液可以自發地形成水凝膠，類似於對含有FG-二氨基酸重複的核孔蛋白的觀察結果。此後不久，Taylor及其同事發現了hnRNPA1和hnRNPA2B1的IDRs中的疾病突變，可以促進它們在體外加速組裝成高級結構複合體。此外，這些突變體促進活細胞中SGs（應激顆粒）的自發形成和動力學顯著降低。幾個團隊後續研究工作表明與疾病相關的IDRs蛋白質如hnRNPA1或融合肉瘤基因（Fusedin Sarcoma, FUS）可以形成液滴。這些發現引起了整個領域對IDRs在相位分離中的重要性和功能性的關注，為真核生物中眾多的蛋白質無序區域存在的合理性提供了又一理論依據。

Box 3 方框3. 異質性對細胞器動力學的影響

核孔複合物在無序區域具有高頻率和弱相互作用的FG基序，但在FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) 實驗中核孔複合物表現出較長的恢復時間。需要考慮的是重複的基序或SLiM可能會產生一系列結合拓撲結構，從而產生大量的等能微觀狀態和更高的能量熵。這需要高度動態的連接序列（例如，IDRs）來實現結合位點之間的最小化耦合併實現多種排列。此外，弱親和性的或非特異性的基序可以同時與多個靶位點相互作用，或甚至通過弱的短程作用與更多的配偶體結合。與一對一結合模型相反，陽離子-π（pi），π-π（pi-pi），芳香氫鍵和範德華相互作用通過替代靶點在不同程度上誘發多價基序之間結合方式的不確定性。基於數學理論的計算模擬實驗表明，與一對一結合模型相比，部分異構交互可以將相界的形成難度降低一個數量級。從這個方面來說，高階組件類似於先驅絡合物 (encounter complex)，它們有助於基序間高效的互作，同時實現快速重組裝。這也意味著異質系統可以在較低的效價下經歷相變。通過很大數目的結構狀態生成不同的冗餘交互模式。儘管意外，構象異質性也可以通過熵效應促進組裝。這正與FUS組裝過程中觀察到的現象一致。總之，不只是組成蛋白的多價性，而且相互作用和結構異質性也可能是無膜細胞器組裝和動力學的關鍵決定因素。由於這種異質性普遍存在於蛋白質相互作用中，因此無膜細胞器相關的分子驅動力可能與傳統的蛋白質複合物和「低階」組裝沒有根本的區別。

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IDRs中的多價交互究竟是如何實現的？這些序列通常富含不帶電荷的極性側鏈（谷氨醯胺，天冬醯胺，甘氨酸，絲氨酸，脯氨酸），帶電荷的氨基酸（精氨酸，賴氨酸，穀氨酸，天冬氨酸）或芳香族殘基（苯丙氨酸和酪氨酸）。有趣的是，這些殘基似乎不是在整個序列中隨機分佈的，而是常以短線性互作基序（short, linear interaction motifs, SLiM）、交互電荷塊或簡併重複序列的形式存在。IDRs的序列偏好性表明它們可能具有一系列驅動相變的作用力，可能包括靜電，偶極-偶極，π-π（pi-pi），陽離子-π（pi），疏水和氫鍵相互作用等（圖2 A，B）。突變研究表明，改變多種殘基類型可以阻止不同LCDs的相位分離。此外，破壞交替電荷塊和重複序列中的關鍵氨基酸突變也會干擾相位分離。

無膜細胞器通常含有核酸，尤其是RNA。此外，與無膜細胞器相關的蛋白質通常具有RNA結合結構域或結合基序，並且無膜細胞器中的RNA會促進各種RBPs的相位分離（圖2C）。同時，若RNA/蛋白質的化學計量比值 (stoichiometries)高，也會抑制相位分離。RNA還調節無膜細胞器的成核和時空分佈。即便是參與葡萄糖代謝的由蛋白質組成的G-bodies也需要藉助RNA發揮生物活性。RNA也可以影響蛋白質液滴的材料特性。最近發現重複排列的RNA通過分子間鹼基配對相互作用發生相位分離，再一次突出了多價性和結構多態性作為相位分離驅動因子的普遍性。（2018年6月Richard Young教授在Science發表超級增強子結合的相變文章 Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control的，文章發現轉錄共激活因子BRD4和MED1可以在超級增強子處聚成液滴樣的核斑，並且該聚合可被化學處理幹擾。BRD4和MED1的IDR（intrinsically disordered regions，IDRs）區可形成相位分離液滴，進而區室化和富集轉錄機器，為超級增強子的轉錄調控在相變角度提供新的解釋。從Richard Young教授的系列研究看超級增強子發現背後的故事 (附超級增強子鑒定代碼)）

4 無膜細胞器的物質形態：液體，水凝膠，團簇

Material States of Membraneless Organelles: Liquids, Hydrogels, and Aggregates

儘管目前科研人員已經對多種蛋白質在試管中進行了相位分離實驗，但是目前關於體外或細胞內與這些相位分離狀態相關的潛在分子機制還未達成共識。卵黃核 (Balbiani body)的相位分離依賴於穩定的澱粉樣蛋白相互作用，而中心粒周物質 (pericentriolar material)和突觸後緻密物(postsynaptic density)是由形成螺旋捲曲的蛋白質之間的相互作用所介導。其它組裝的機制則不明朗。為了更好的理解應激顆粒（SGs）的內部結構，科學家投入了大量的精力。SGs的形成被認為是細胞應激反應的一種形式——當細胞受到壓力時SGs形成，但是是可逆的。Parker實驗室最近的工作表明，僅基於試管實驗來看，細胞中的情況可能遠比我們想像的要複雜。SGs具有穩定的核心，可以抵抗稀釋，這體現了SGs的非液體特性。儘管這一結果不能排除自發的相位分離和凝膠化相結合是形成SGs的路徑之一，但數據表明，SGs的分解可能是迫使物質脫離kinetic traps的驅動過程。事實上，超解析度顯微鏡和交聯實驗已經證實了SGs具有不穩定的液體外殼。這些結果指出了SGs有著複雜的內部結構，其他的無膜細胞器可能也是如此。

一些應激顆粒（SG）蛋白的錯義突變會導致例如肌萎縮側索硬化（ALS）等神經退行性疾病，並且突變型和野生型蛋白都會在神經元中聚集。SGs是動態組裝形成的，它們的聚集物可能具有原纖維結構。 FUS和hnRNPA1是此類SG蛋白的實例，都具有長的，低複雜性的蛋白質區域，並且在ALS病人中發生了突變。McKnight及其同事的初步研究發現，這些無序的結構域可以形成可逆轉的水凝膠，依賴於不穩定扭曲的 β摺疊。有趣的是，膠凝/溶解的重複循環促進了水凝膠從可逆轉凝膠向不可逆轉凝膠的轉變。通過對全長FUS和hnRNPA1或低複雜性區域形成的液滴的研究人們提出了不同的假想機制。低複雜性蛋白質區域在這樣的液滴中，似乎保持其無序的傾向，這與它們的單體狀態類似。然而，對於許多由低複雜性蛋白質區域形成的液滴，特別是在含有全長蛋白質的情況下，最終將發展為成熟纖維狀固體聚集體。並且，ALS引起的突變可以提高成熟率。兩種不穩定的凝膠和液體向固體的轉變可以解釋ALS中SGs向聚集體的病理轉化，但它們與細胞SGs和聚集體的確切關係仍未確定。

5 特異性的產生與維持

How Is Specificity Generated and Maintained?

有趣的是，許多蛋白質同時存在於多個不同的無膜細胞器中。由於這些蛋白質在多價蛋白質中顯著富集，因此不可避免地會出現什麼決定了組裝的特異性和完整性的問題：如何防止不同無膜細胞器的融合？如何維持無膜細胞器內的不同子隔室？（例如在覈仁中：圖1D）如何組裝和控制核仁等多相系統？最近的研究表明，蛋白質液滴的表面張力差異可以介導這種多相液滴的形成。兩個亞核區室的關鍵組分可以獨立地發生相位分離，但所得的液滴具有不同的表面張力。當混合在一起時，這些液滴不會融合，而是以液滴內的液滴形式排列，這與核仁非常相似。這個例子揭示了一個更普遍的原則，可以作為解釋其他無膜細胞器中多相行為的理論基礎。

除了物理性質之外，顆粒組裝的特異性可能源於蛋白質-蛋白質之間直接互作的特異性。經歷相位分離的IDPs和蛋白質富含短線性互作基序（SLiM）和簡併重複序列。它們都是蛋白-蛋白互作的主要參與區域 (圖2A，B）(生信寶典之傻瓜式(四)蛋白蛋白互作網路在線搜索)。此外還可能與IDPs的其他特徵有關，例如重複結合基序的數量和間隔（多價性），它們的翻譯後修飾（PTM）或中間接頭區域的動態變化 。非特異性靜電相互作用，特別是與RNA的相互作用，對於液滴組裝成核至關重要。並且不同的IDRs對離子強度變化的響應不同。儘管SLiMs具有一定程度的特異性，但多個SLiMs的加性效應可能共同決定了相變形成的組裝複合體的物理特性和組成。

（A. 蛋白質相位分離中觀察到的不同類型的接觸； B. 相位分離蛋白的實例說明瞭多價性的重要性，高亮顯示蛋白內的一系列互作模塊； C. 調節蛋白質相位分離的物質狀態和形成凝集核的不同機制。高顏值可定製在線作圖工具-第三版(操作更簡單)）

另外，無膜細胞器中的幾種關鍵蛋白質具有可摺疊的二聚或寡聚結構域。例如，G3BP1含有被SG(stress granules)靶向的可摺疊二聚化結構域。類似的例子還有PML、Cajal bodies和核斑點 (nuclear speckles)。TDP-43可通過LCDs中的瞬變的α螺旋二聚化進行相位分離，並且可以通過摺疊的N末端結構域進行多聚化(圖2B)。這表明對於一些蛋白質，相位分離可以通過兩種不同的機制發生。這兩種機制是通過蛋白質結構生理的角度偶聯在一起的。Brangwynne實驗室的工作為這種裝配機制提供了有說服力的證據。Shin等人使用植物來源的光誘導蛋白寡聚化結構域來提供驅動蛋白質-蛋白質相互作用的光遺傳學研究途徑。將該寡聚化結構域融合到已知驅動相位分離的LCDs產生的工程蛋白可在光刺激下在細胞中形成液滴。這些所謂的光液滴 (「optodroplets」)表明，特定的寡聚化結構域與LCDs的組合確實是介導特定細胞相變的有效機制。寡聚化結構域，捲曲螺旋 (colied-coils)和β-拉鏈 (β-zippers)可以提供驅動無膜細胞器形成所需的倍增粘性互作(圖2B）。有趣的是，最近發現多種無序蛋白質富含不穩定的β-拉鏈區域，也就是推動FUS凝膠化的區域。

很明顯，無膜細胞器和靶向細胞器的配體蛋白質的結構成分之間有明顯的區別。然而，區分這些行為的確切分子特徵目前仍然未知。對於某些組裝體的偏好配體蛋白的選擇可以簡單地由隔室的組件引入的物理限制來介導 (Preference of client proteins for certain assemblies couldsimply be mediated by the physical restrictions introduced by the constituentcomponents of the compartment.)。蛋白質液滴/凝膠中的相互作用陣列產生具有特定網格尺寸的網路。通過允許網格尺寸以下的小分子自由擴散通過網路，同限制較大分子的進入，充當擴散屏障。另外，無膜細胞器可以錨定在空間中，從而防止擴散和融合。例如，聚集體 (Aggresomes, aggregation of misfolded proteins)是由細胞骨架在覈周的錯誤摺疊而形成的蛋白質沉積物，這阻止了錯誤蛋白在細胞內的擴散.

6 時空調節

Spatiotemporal Regulation

在試管中能自發進行相位分離的蛋白知道的越來越多，但是細胞是如何對這一過程進行精確控制的仍然令人費解。例如，幾種RNA結合蛋白 (RBP) 在遠高於其體外飽和濃度的細胞濃度下卻完全可溶，但是他們只在特定條件下發生相變。簡而言之，細胞如何能夠避免自發和不可控的相位分離？這個問題與前面提到的相變特異性起源的觀點密切相關。

不同實驗室的工作都表明，絲氨酸和酪氨酸磷酸化、精氨酸甲基化和泛素化等都可以控制相位分離。重要的是，雙特異性激酶DYRK3的活性被證明是SG (stress granules)溶解所必需的，這表明可能存在控制這些過程的細胞開關。有趣的是，易於發生相位分離的蛋白質似乎富含被翻譯後修飾（PTM）的殘基。實際上，蛋白的翻譯後修飾（PTM）可以顯著地改變這些IDRs/ LCDs的電荷或其他性質，從而將序列固有驅動力轉變為相位分離(圖2C)。

細胞控制相變的另一種方法是控制細胞濃度和細胞內物質分佈（如介導相位分離的蛋白質的散在分佈）（圖2C）。hnRNPA1的細胞濃度高於其體外飽和濃度，但這些分子仍然可溶於細胞核的原因尚不清楚。阻斷hnRNPA1的核輸入，導致其在細胞質中的積累，從而致使 SGs (stress granules)的自發形成。並且，核轉運因子本身就是SGs的組成部分，說明核質轉運過程可能會以多種未知的方式控制相位分離。

由於RNA參與形成多個無膜細胞器，特定RNA種類的存在與否也可以在特定時空層面調節相位分離（圖2C）。例如，非編碼NEAT-1 RNA的表達對於散斑 (para-speckle)的形成是必需的。此外，細胞應激下的多聚核糖體解離促使細胞質包含更多遊離mRNA，隨後使SG (stress granules)成核。正常狀態或應激響應被激活時，抑制多聚核糖體的解離都可以阻止SG的形成。此外，經典的應激顆粒標記物poly（A）結合蛋白（PAB1）在響應熱應激時會發生相位分離，釋放其結合的RNA。這表明翻譯響應和SG形成之間存在複雜的關係。

7 疾病、病理及衰老

Disease, Pathology, and Aging

一些在神經退行性疾病中的關鍵蛋白是無膜細胞器的組件，因而這些組件的裝配在形成、維持或清除過程中發生某些錯誤的調節可能導致病態聚合的形成。事實上在試管和細胞中持續數小時的觀測發現，動態蛋白液滴及水凝膠會自發成熟化，形成固態聚合。此轉換表明這種動態的裝配可能具有亞穩定性或天然不穩定性，並且特定的細胞過程可阻止這種固化過程的發生(Figure 2C)。這種從液體到固體的相變可被疾病相關突變所促進，表明相變（phase transition）對於病理研究的重要性。這些疾病突變似乎靶向存在於內在無序區（intrinsically disordered regions，IDRs）的β拉鏈結構域，使其更加傾向於摺疊為穩定的澱粉樣結構。值得注意的是，目前還沒有直接的證據表明在病人的大腦中，病態的蛋白質聚集是由應激顆粒(stress granules, SGs)或其他無膜細胞器的凝固化造成的。

疾病突變也可能通過產生異常的蛋白質和RNA種類來影響相位分離。在這方面，重複序列擴增導致的功能異常尤其有趣。其中的一些異常包括重複RNA位點的形成，後者可捕獲RNA結合蛋白，導致其功能喪失。有趣的是，這種RNA重複序列自身可通過多鹼基配對進行相位分離，與病人體內觀察到的現象一致。此外，一些RNA重複序列可翻譯併產生有重複序列的多肽。例如，引發肌萎縮側索硬化症的GGGGCC序列重複可產生不同的二肽重複序列。其中的兩個被稱為甘氨酸——精氨酸、脯氨酸——精氨酸的二肽重複序列，定位於不同的無膜細胞器，包括應激顆粒體（SGs）。包含這些致病肽段的SGs (stressgranules)有較小的動態性，而且還招募了一些易於產生聚集的蛋白質，如TDP-43。

SGs (stress granules)的清除依賴於自噬。自噬基因的突變是導致各種疾病的原因，包括肌萎縮側索硬化。另外自噬作用也隨著年齡的增長而變弱。除了自噬之外，分子伴侶也都參與了保持SG (stress granules)的易變性和可清除性。這些觀察結果表明，細胞若無法對這些程序進行嚴格控制可能導致病理聚合。核轉運也因年齡老化而衰退，並且越來越多地被發現參與到蛋白質聚集引起的疾病中。

線粒體功能紊亂是衰老和神經退化的基礎，因其可能會導致ATP水平下降，從而影響無膜細胞器的調節。大量的SG (stress granules)蛋白含有ATP酶結構域，並且降低細胞的ATP水平會降低細胞器的動態特性。另外，有證據表明，細胞ATP可以作為化學助溶物直接阻止相位分離和聚合。ATP的這個特徵獨立於它在激活細胞進程中提供能量的作用。因此在老化和疾病中，線粒體呼吸功能的缺陷可能促進蛋白質聚集，要麼通過整體地減少細胞ATP水平，要麼是由於依賴ATP的可維持無膜細胞器流動性的生物通路的損傷導致的。

蛋白翻譯後修飾（PTMs）在相位分離調節中具有重要作用，並且值得注意的是，一些病理蛋白質聚集顯示了特定的PTM特徵。例如，Tau磷酸化（Tau phosphorylation）是阿爾茨海默病（ALS）病理的一個標誌。有趣的是，tau磷酸化促進了體外的聚合和相位分離。

儘管蛋白質聚集和相變大多是在神經退行性疾病的背景下進行研究的，但它們與各種各樣的病理條件有關，包括病毒感染和癌症。與神經退化相關的一些關鍵蛋白質也與不同類型的癌症有關聯。例如，在ALS中參與應激顆粒 (SG)靶向和聚合的FUS蛋白（一個RNA結合蛋白）的低複雜域（low-complexity domains, LCD）已被證明在脂肪肉瘤中發生了致癌融合。事實上，癌症相關的融合蛋白通常富含無序的低複雜性功能域，表明這可能是一種常見的機制。FUS蛋白的低複雜區域的轉錄激活潛力，以及它的人類同源物EWSR1和TAF15蛋白（三者在一個癌症家族中有關聯）的轉錄激活潛力，與它們在體外的水凝膠結合能力以及招募聚合酶II的C端區域到所在水凝膠的能力高度相關。FUS蛋白的低複雜域和它的同源基因介導轉錄激活的機制雖然還不清楚，但被認為是與相位分離過程有關的。此外，增加的SG (stress granules)和旁斑（paraspeckle）的形成與癌症存活的預後率低有關。最近的研究發現，腫瘤抑制基因p53的聚合導致其功能喪失，是癌症的主要機制，而阻止其聚合的化合物在臨牀前動物模型實驗中取得了成功。（生信寶典之傻瓜式(六)查找轉錄因子的靶基因）

SGs也參與到抗病毒的應激反應中，並且病毒已經進化出了許多幹擾SG裝配的方法。此外，一些病毒，如蟲媒病毒 (flaviviruses)，包括寨卡病毒，甚至劫持了SG蛋白來輔助自身的複製。儘管還處於起步階段，但由於蛋白質聚集和相位分離與許多人類病理狀態相關，因此更好地理解這些過程將幫助在更廣闊的人類醫學領域中發展新的治療策略。

8 通向新的治療途徑

Road Toward Novel Therapy?

如前所述，我們提出蛋白質相位分離與病理蛋白聚集和疾病密切相關的假說。但只有在徹底理解了背後的調控機制並研發出新的疾病治療方式後，才能說明該假說的成立。細胞的相變可以被幹擾疏水或極性相互作用的不同化學物質所調控。然而，這種非定向化合物可以靶向細胞中的大部分無膜細胞器，可能並不是疾病治療的最佳選擇。

反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotides, ASOs)提供了一個可能合適的可選方法，可特異性地敲低異常相變中的關鍵參與者。雖然針對病理蛋白的ASOs在不同的小鼠模型中取得了成功，但其應用僅限於非致死性(non-essential)蛋白。對於致死性蛋白，ASOs可以靶向其非致死性的功能分子伴侶，進而調節相變。以ALS模型中致死性蛋白TDP-43為例說明該方法的可行性。Ataxin-2已在動物模型和人中被確認為是ALS疾病的調節因子。隨後的研究表明，Ataxin-2直接招募TDP-43到SGs，這為它促進TDP-43的聚集提供了一種機制解釋。與TDP-43敲低不同，Ataxin-2的敲低（KD）在小鼠中耐受良好。確信的是，ALS小鼠模型中敲低Ataxin-2降低了小鼠脊髓中TDP-43聚集物的數量，顯著延長了存活率。類似的，敲低與Tau相互作用的SG蛋白Tia-1可在培養的神經元和嚙齒動物模型中抑制Tau病理和毒性。這些研究充分表明，通過ASO技術靶向相變是阻止TDP-43和Tau蛋白病理性聚集的可行策略，也可能適用於其他蛋白聚集性疾病的治療。（R語言學習 - 非參數法生存分析）

最後，考慮到蛋白質的聚集和相位分離受到細胞蛋白質降解及分子伴侶機制的嚴格控制，目前的工作重點是尋找能上調這些通路的藥物，或產生能拮抗病理相變的強效工程學解聚分子。闡明蛋白的相位分離的複雜調控機制將是識別新通路的關鍵，進而靶向新通路矯正病理性相變。

9 結束語

Concluding Remarks

近年來，關於大量細胞器是通過相位分離形成的認識越來越清晰。雖然這些細胞器已經被研究了幾十年(或者如核仁，已經研究了一個多世紀)，但它們的動態性質及這種動態性與無膜細胞器的形成、功能和生理病理的關係直到最近才被揭示。利用聚合化學的先進技術優勢，在快速發展的細胞生物學領域中，對無膜細胞器的認識有了顯著的提高，並開發了進一步探索其潛在生物物理學行為機制的新方法。毋庸置疑，這些新發現已經為靶向人類疾病發生中的異常蛋白相變提供了新的思路。此外，瞭解序列和所產生的物質狀態之間的關係也可能促進產生新的合成生物學材料。

然而我們必須充分意識到，我們還遠未完全瞭解無膜細胞器背後的複雜生物學機制以及它們的功能與作用。為此列出了我們認為仍未解決的關鍵問題(見OutstandingQuestions)清單。解決這些問題對於進一步深入瞭解蛋白質的相位分離是至關重要的。開發新的分子生物學和細胞生物學工具是完成這個目標所必須的。目前，無膜細胞器的純化和高解析度結構研究仍是一個瓶頸，特別是在活體細胞環境中。只有開發出特異性地靶向單個顆粒體的工具，我們才能將這些顆粒體用於新的疾病治療，並將我們的基本生物學知識應用於臨牀。蛋白質的相位分離還沒有展示出其所有的奧祕，一個令人興奮的未來即將到來。

Box 4 方框4. 無膜細胞器的功能是什麼？

許多蛋白質似乎已經進化出驅動無膜細胞器形成或被募集到無膜細胞器的能力。然而為什麼細胞需要這樣的結構？他們的生化功能是什麼？令人驚訝的是，這些問題基本上沒有答案。

不同形式和尺度的區室劃分在生物體廣泛存在。 我們的胃是一個功能確定的器官，它只有一個主要目的，即通過酸水解消化食物。顯然，如果身體能把食物和酸都集中到一個單獨隔室中，化學反應進展更順暢。 另外，這種區室可以保護其他器官免暴露於酸環境中。 同樣，我們的細胞也進化出一種驚人相似的機制，如溶酶體產生酸性隔室以降解細胞廢物。 通過膜屏障，溶酶體可以濃縮反應組分，同時保護細胞的其餘部分免受傷害。器官-細胞器水平相對應的另一個例子是脂肪組織和脂滴，他們以脂質的形式儲存能量供以後使用。 此外，身體和細胞可以通過區室化信號接收放大來自環境的信號：眼睛將入射光聚焦到富含光接收器的視網膜上。在亞細胞水平上，神經元也將它們的受體集中在不同的子結構中，即突觸。 從以上類比中，可發現區室化的四個主要功能，即：（i）濃縮(生)化反應的成份；（ii）隔離有害成分；（iii）生物分子的儲存；（iv）信號放大。有趣的是，所有這些功能都存在於無膜細胞器領域。首先，通過相位分離濃縮細胞骨架組分促進它們成核變為絲狀物，並且類似地，剪接也是通過mRNA上的剪接因子的多價組裝來控制的。其次，雖然疾病中的蛋白質聚集體被認為是有害的，但越來越多的證據表明它們也可能是細胞最初的拯救機制–隔離毒性更高的蛋白質寡聚體。第三，許多組件起到儲存顆粒的作用，因為它們在面對應激或靜息狀態時可隔離蛋白質和其他生物分子，以便以後再次使用。第四，通過濃縮受體和信號分子，細胞可以放大某些信號傳導途徑。鑒於此，不同的膜受體可通過蛋白質相位分離實現這個功能。 雖然我們還沒有完全揭示細胞中相位分離的複雜功能，但這些例子讓我們大致瞭解了為什麼細胞可以受益於無膜細胞器的形成。

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10 重點問題

Outstanding Questions

1. 相位分離確切的生物學功能是什麼？為什麼細胞會進化產生無膜細胞器？是什麼讓液體/凝膠組成在功能上與經典蛋白質複合物不同？
2. 我們對驅動相位分離的物理動力有了基本的瞭解，但在原子水平對互作的的深入瞭解會幫助更好地理解這些相變的機制。
3. 不同無膜細胞器的必須和非必須組成部分是什麼，它們的序列和結構特性是什麼？
4. 儘管有一些例子，但我們對細胞中相位分離的時空調節機制知之甚少。這將是理解生物學如何調節物理學的關鍵。涉及哪些調控通路？
5. 目前無膜細胞器組成的特異性程度的認知和預測完全不清楚。如什麼介導蛋白質和RNA形成特定相，以及什麼阻止了不同的無膜細胞器的聚結？
6. 雖然在體外試管中確定胞體顆粒的內部結構方面取得了一些進展，但缺乏在活細胞中研究該問題的工具。即如何在體內研究無膜細胞器的內部組織？
7. 生理和病理組裝有什麼區別？哪些因子驅動病變？
8. 疾病突變和衰老如何特異性地影響無膜細胞器成分的相位分離？相關的分子事件有哪些？
9. 為什麼與蛋白質聚集相關的疾病會顯示出如此明顯的細胞類型特異性？什麼使（特定）神經元對蛋白質穩態中的幹擾特別敏感？

原文：Protein Phase Separation: A NewPhase in Cell Biology

翻譯：凌路頔 劉晉芸 宋紅衛

文章原文: http://blog.genesino.com/2018/08/phase/

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