上期回顧幾篇方法學的文章，下面我們轉向分子功能和機制研究領域。通過比較處理組和對照組或者疾病組和正常組之間的差異表達基因，是找出具有潛在功能基因的最常用手段之一。目前蛋白質組高通量高靈敏度的技術無疑是有力的工具。記得之前實驗室的一位老師曾經對我們說過，對於探究分子機制的研究人員來說，我們蛋白質組學的工作只是在文章中的「第一張figure」。接下來的一篇文章，就讓我們聊一聊典型的「第一張figure」研究。

2018年3月，Nature雜誌發表了題為「The protein histidine phosphatase LHPP is a tumour suppressor1」的letter文章，本文的通訊作者是大名鼎鼎的Michael Hall教授，其因發現TOR蛋白及其在細胞生長代謝的調控作用而聞名於世。當然，這篇文章所採用的生物模型，也是通過特異性敲除PTEN和TSC1基因，激活mTOR信號通路，而構建的小鼠肝癌模型（liver-specific double-knockout , L-dKO）。

首先研究人員使用L-dKO模型鼠的肝臟組織與正常肝臟組織進行了差異蛋白質組學分析，其中有兩個Histone kinase NME1和NME2上調，這兩個蛋白是在哺乳動物中已知僅有的兩個組氨酸激酶；而另一個推測的組氨酸磷酸酶LHPP（phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase）在肝癌組織中，明顯下調（Fig. 1）。好了，利用蛋白質組學的部分到此結束，本篇文章分享結束。

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開玩笑的，我們還是把這篇文章聊完。之後研究人員使用WB對這一結果進行了確認。（貌似這是生物學家的習慣，質譜結果一定要用WB二次驗證）為了確認LHPP的下調是否與腫瘤的發生髮展相關，研究人員使用了不同時間點的L-dKO鼠肝臟檢測LHPP的含量變化。自然的，在16周出現肉眼可見的腫瘤組織中，LHPP有輕微下調，而到20周時，下調十分明顯。這就說明了，LHPP的下調確實與腫瘤的發展具有一定的聯繫。（Fig. 2）

既然在模型小鼠的肝臟中發現了兩個組氨酸激酶和一個「假定」組氨酸磷酸酶的上調，自然就要研究一下肝癌組織中磷酸化組氨酸的表達情況。研究人員使用了最近開發的針對pHis的多克隆抗體來檢測pHis的表達情況（可惜沒有使用上文中提及的Heck教授開發的富集方法），同時使用熱激方式去除不穩定的組氨酸磷酸化修飾來確認抗體的結果，和預料相同，腫瘤組織中的pHis具有高表達的特徵。

為了確證LHPP確實是組氨酸磷酸酶，並尋找其底物，研究人員又進行了一系列實驗。除了常用的體外酶反應體系外，作者還在L-dKO小鼠肝癌細胞CB1中，重新表達了LHPP，結果發現3-pHis（組氨酸咪唑環N3位磷酸化）顯著的下調，並且通過IP-MS的方法（總算又出現了MS！），鑒定到了9個潛在的LHPP底物，其中就包括已知的pHis蛋白ACLY。這些結果確認了，LHPP確實具有組氨酸磷酸酶的活性。

接下來再回到腫瘤的發生髮展過程中，那麼LHPP是否在這個過程中起作用呢？一系列的細胞實驗證實，增強LHPP的表達，能減緩細胞增殖，並且在CB1細胞系中，阻礙hepatosphere形成？接下來在L-dKO小鼠成瘤過程中，通過注射腺病毒在肝臟中特異性表達LHPP，能有效的抑制肝癌的發展，並且在實驗組的腫瘤部分，同樣檢測到了LHPP的低表達。這些結果說明，LHPP的下調，在腫瘤的發生髮展中是必要的，LHPP蛋白是tumor suppressor。（Fig. 4）

動物實驗完成之後，就要向臨床邁進。在HCC的病人樣本中，通過WB和IHC，同樣檢測到了NME1和NME2上調和LHPP的下調，並且整體上pHis的表達在腫瘤組織中也相對較高。那麼LHPP的表達是否會與病人的預後相關？在查詢了TCGA的數據後，研究人員發現，LHPP低表達的病人確實具有較差的預後，其DFS和OS的中位生存時間，僅有12個月和38個月；而LHPP表達正常的病人，數值則為25個月和61個月。（Fig. 5）進一步的調查發現，在TCGA和ICGC資料庫中，共找到了49個LHPP的突變，其中失活突變佔到了20%以上。這些結果均說明，組氨酸磷酸酶LHPP，和與其功能相關的組氨酸磷酸化修飾，在腫瘤的發生髮展中起到重要作用，並且能在一定程度上預測臨床的預後。

這篇文章也就到此為止了，這是一篇非常經典的「模型構建-組學發現-生物學驗證-臨床相關數據」研究，希望給同學們有一定的啟發。

好的，篇幅有限，還有許多優秀的文章沒來得及和大家聊一聊，本期節目就要和大家說再見了，下期的欄目有沒有或者會不會按時發表就要看心情了，畢竟你們的好朋友Spring已經累得半死了。

最後，無論您什麼時候看到了這篇文章，都祝您早安，午安，晚安。

作者：Spring

編輯：張俏

參考文獻：

Hindupur, S. K. et al. The protein histidine phosphatase LHPP is a tumour suppressor. Nature 555, 678-682, doi:10.1038/nature26140 (2018).

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