清香大麴及酒醅中地衣芽孢桿菌的分離鑒定 三億文庫
清香大麴及酒醅中地衣芽孢桿菌的分離鑒定 芽孢桿菌是大麴中常見微生物，也是重要類羣之一。地衣芽孢桿菌一直以來被認為是醬香型白酒高溫大麴中特有的微生物，就我們研究發現，在牛欄山酒廠生產用的多種清香大麴、出池酒醅中同樣存在地衣芽孢桿菌，對分離出23株芽孢桿菌進行生理生化實驗，鑒定出12株地衣芽孢桿菌，鑒定結果與中國食品發酵工業研究院分子鑒定結果一致。本文主要介紹地衣芽孢桿菌的生理生化鑒定實驗方法，為地衣芽孢桿菌的鑒定提供比較完備的一套方法。
1 地衣芽孢桿菌的分離
1.1材料
牛欄山酒廠生產用清香大麴、釀酒車間酒醅
1.2分離用培養基
肉汁培養基：牛肉膏0.3％，蛋白腖1.0％，NaCl 0.5％，瓊脂2.0％，pH 7.0-7.2，121℃，滅菌30min。
1.3分離方法
取大麴乾粉或酒醅0.5g，加入帶有玻璃珠的無菌水三角瓶中，搖牀培養30min，60℃水浴30min，然後用接種環蘸取，在肉汁培養基平板上劃線分離。挑取單菌落繼續劃線分離，直到得到單菌落純菌株為止。
2 地衣芽孢桿菌生理生化鑒定實驗
根據上述分離培養基和分離方法，共計分離得到芽孢桿菌23株，編號分別為1＃、2＃、3＃、4＃……22＃、23＃，接下來通過實驗對這些菌株進行篩選和鑒定。地衣芽孢桿菌鑒定參考《伯傑氏細菌鑒定手冊》及《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠，蔡妙英等編著）的方法，有所改進，以下為具體的生理生化實驗鑒定方法。
2.1檸檬酸鹽與丙酸鹽利用實驗
某些細菌能利用檸檬酸鹽或丙酸鹽作為唯一碳源，並利用磷酸銨作為氮源，將檸檬酸分解為二氧化碳，則培養基中由於有遊離鈉離子存在而呈鹼性。培養基配方：檸檬酸鈉（或丙酸鈉）0.2％，NaC1 0.5％，MgSO4?7H2O 0.01％，(NH4)2HPO4 0.1％，K2HPO4?3H2O 0.1％，1%溴百里酚藍水溶液10ml，瓊脂2％。以上成分除指示劑外其餘加熱溶解，調節pH＝6.8-7.0，並加入指示劑，使培養基呈草綠色，分裝試管，滅菌後擺斜面。
取幼齡菌種接種於斜面上，適溫培養3-7d，培養基呈鹼性（藍色）者為陽性反應，不變者為陰性。只有地衣芽孢桿菌可以利用丙酸鈉，為陽性反應，而其他芽孢桿菌均不能利用丙酸鈉，為陰性反應，但很多種芽孢桿菌都可以利用檸檬酸鈉。
2.2產酶實驗
2.2.1過氧化氫酶實驗
過氧化氫酶又稱接觸酶，能催化過氧化氫分解水和氧。將芽孢桿菌接種於肉汁培養基斜面上，適溫培養18-24h。取乾淨的載玻片，在上面滴1滴3-5％的H2O2，挑取1環培養18-24h的菌苔，在H2O2溶液中塗抹，若有氣泡（氧氣）出現，則為過氧化氫酶陽性，無氣泡者為陰性。也可將過氧化氫溶液直接加到菌種斜面上，觀察氣泡的產生。
2.2.2澱粉酶實驗
某些細菌可以產生分解澱粉的酶，把澱粉水解為無色糊精等小分子，或進一步水解為麥芽糖或葡萄糖。澱粉水解後，遇碘不變藍色。
培養基：在肉湯蛋白腖瓊脂中添加0.2％的可溶性澱粉，分裝三角瓶，121℃ 20min滅菌備用。盧戈氏(Lugol)碘液：碘片1g，碘化鉀2g，蒸餾水300ml，先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，混勻，定容。
將滅菌後放入培養基冷卻到50℃左右，倒成平板，凝固後，取18-24h的純培養物點於平板上，每皿可點種3-5個菌株，適溫培養2-4d，形成菌落後，在平板上滴加盧戈氏碘液，以鋪滿菌落周圍為度，平板成藍色。如果菌落周圍有無色透明圈出現，說明澱粉已經被水解，實驗為陽性，否則為陰性。透明圈的大小一般說明水解澱粉的能力。
2.2.3 纖維素酶實驗
採用剛果紅染色法，如果有剛果紅存在，剛果紅可以與纖維素結合成紅色螯合物，培養基顏色為紅色。如果培養基中有能夠產纖維素酶的細菌，將纖維素分解，不能形成螯合物，在菌落周圍形成透明圈。這樣可以鑒定產纖維素酶的細菌。 培養基的配製：CMC-Na 5-10g，酵母膏 1g，KH2PO4 0.25g，瓊脂15g，將上述物質溶解後,用蒸餾水定容到1000ml，加入5ml 10mg/ml的剛果紅溶液，121℃，滅菌20min，冷卻倒平板，凝固後待用。取18-24h的培養物點於平板上，每皿可點種3-5個菌株，適溫培養2-4d，形成菌落後，觀察產生透明圈情況，產生纖維素酶的菌落周圍將會出現明顯的透明圈，否則為陰性。
2.2.4明膠液化實驗
明膠是一種動物性蛋白，明膠的水解是由於有些細菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進一步水解為氨基酸，失去凝膠性質而液化。明膠培養基本身低於20℃凝固，高於24℃則自行液化。明膠分解後，其分子變小，雖在低於20℃的溫度下也不再凝固。培養基：蛋白腖5g，明膠120g，蒸餾水1000ml，調節pH7.2-7.4，分裝試管，培養基高度約4-5cm，115℃ 20min滅菌。
挑取18-24h培養物，以穿刺法接種於試管中央，於20-22℃培養。每天觀察結果，液化為陽性，否則為陰性。
2.3需厭氧實驗
在培養基中加入還原劑，如巰基醋酸鈉和甲醛合次硫酸鈉等，以除去培養基中的氧氣或氧化型物質，使厭氧菌能在有氧情況下生長。培養基：酪素水解物20g，NaC1 5g，巰基醋酸鈉HS?CH2COONa 2g，甲醛合次硫酸鈉HOCH2?SO2Na 1g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，調節pH 7.2，分裝試管121℃滅菌20min，培養基不擺斜面。
用1環肉湯菌液，穿刺接種到上述培養基中，必須穿刺到管底。30℃培養3-7d觀察結果。如細菌在瓊脂柱表面上生長者為好氧菌，如沿著穿刺線生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌。
2.4乙醯甲基甲醇實驗(V.P實驗)
某些細菌在葡萄糖蛋白腖水培養基中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙醯甲基甲醇，後者在強鹼環境下，被氧化為二乙醯，二乙醯與蛋白腖中的胍基生成紅色化合物，稱V.P陽性反應。培養基：蛋[FS:PAGE]白腖5g，葡萄糖5g，NaC1 5g，蒸餾水1000ml。調節pH7.0-7.2，分裝試管，每管約裝4-5ml，115℃滅菌20min。試劑：40％NaOH（或KOH），肌酸。
接種於上述培養液中，適溫培養4-6d。如為陰性，可適當延長培養時間。取培養液（約2ml）和等量的40％NaOH相混合，加少量（約0.5-1.0mg）肌酸，充分振蕩2-5min，如培養液出現紅色即為陽性。有時需放置更長時間或在熱水中稍加熱，以加速反應進行。
2.5酪素水解實驗
牛奶平板的製備：取5g脫脂奶粉加入50ml蒸餾水中（或用50ml脫脂牛奶），取1.5g瓊脂溶於50ml蒸餾水中，將兩溶液分開滅菌。待冷至45-50℃時，將兩液混勻倒平板，即成牛奶平板。將平板倒置過夜，使表面水分乾燥，然後將菌種點接在平板上，每皿可點接3-5個株菌。適溫培養3-5d，記錄菌落周圍和下面酪素是否已被分解而呈透明。配製該培養基時，切勿將牛奶和瓊脂混合滅菌，以防牛奶凝固。
2.6酪氨酸水解實驗
有些細菌具有酪氨酸酶，能使含酚類的化合物如酪氨酸、酚等氧化成醌，再經脫水、聚合等一系列反應，最後形成黑色沉澱物質。培養基：採用肉湯蛋白腖培養基加0.1％L-酪氨酸，調節pH為7.0，分裝121℃滅菌20min後擺成斜面。接種後培養3-7d，觀察斜面有黑色素者為陽性反應。
2.7酸性培養基實驗
培養基：蛋白腖10g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml，調節pH 5.7，115℃滅菌20min。取菌液一環，接種於上述培養基中，同時接種普通肉湯液（pH 7.0）作對照。適溫培養1-3d內觀察生長情況。該培養液要求十分澄清，pH必須準確，用pH計調測。
2.8耐鹽性實驗
耐鹽性實驗是觀察滲透壓對細菌生長的影響。由於不同菌類耐鹽性不同，故常以此作為鑒別特徵。一般可根據不同種類的菌株，選擇其適合生長的培養基，在其中加入不同量的NaCl，接種後觀察其生長與否，以判斷其耐鹽性。
根據鑒定需要，以肉湯培養液配成不同濃度NaCl溶液，如2％、5％、7％、10％等。培養基要求十分澄清，接種時應採用幼齡菌液接種，適溫培養3-7d，與未接種的對照管對比，目測生長情況。
2.9生長溫度實驗
細菌生長的最高、最適、最低溫度，常常是某些細菌鑒定的特徵之一。測定細菌的生長溫度，要求培養液十分澄清（如營養肉汁培養基），並採用液體菌種直接接種，放置於恆溫水浴培養。在指定溫度下培養2-5d，觀察生長情況。若在接近0℃的低溫培養，則觀察時間可延長7-10d或更長。培養5d能生長者按生長計算，否則按不生長計算，可疑者需重新進行培養實驗。
2.10產醬香實驗
地衣芽孢桿菌在醬香型白酒生產中的一個重要作用就是產生醬香物質，這與其產生蛋白酶類有關，蛋白酶將蛋白質分解成肽類和氨基酸，經過發酵會產生醬香物質。本實驗採用三種培養基鑒定地衣芽孢桿菌是否產生醬香物質。
甘氨酸培養基：甘氨酸5g，葡萄糖10g，NaCl 3g，蒸餾水1000ml，pH 6-7，分裝50ml到100ml三角瓶中，121℃滅菌20min。營養肉汁培養基：牛肉膏3g，蛋白腖10g，NaCl 5g，蒸餾水1000ml，pH 7.0-7.4，分裝50ml到100ml三角瓶中，121℃滅菌30min。以上兩種培養基均為液體培養基，取培養18-24h菌種接入到液體培養基中，搖牀37℃培養48-60h，取出，鑒定是否產生醬香物質。
麩皮培養基：麩皮1000g，NaOH 6g，蒸餾水600ml，分裝到500ml三角瓶中，121℃滅菌40min。接入液體培養菌種10％，恆溫箱培養3-5d，取出，鑒定是否產生醬香物質。
2.11糖發酵實驗
糖發酵實驗主要是看該種糖能不能被微生物利用，如果能夠利用則會發酵產酸，培養基中的指示劑會由紫色變黃色，同時可能伴有氣泡產生，如果發酵產氣則試管中倒扣的杜氏管中培養基會被排出，裡面充滿氣體。本實驗中糖發酵實驗選取葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露醇、阿拉伯糖、木糖等。培養基配方為：(NH4)2HPO4 1g，MgSO4?7H2O 0.2[FS:PAGE]g，KC1 0.2g，酵母膏0.2g，糖或醇類10g，蒸餾水1000ml，0.04％溴甲酚紫乙醇溶液20ml，調節pH 7.0-7.2，分裝試管，每管裝10ml培養基，試管內放有杜氏發酵管，115℃滅菌20min，排凈杜氏管中的空氣。
以18-24h的幼齡菌種，接種一環到上述培養基中，適溫培養3-5d，觀察指示劑是否由紫色變黃，杜氏管中是否有空氣。
3生理生化實驗鑒定結果（具體結果見附表1，2，3）
3.1檸檬酸鹽與丙酸鹽利用實驗結果
23個菌株均可以利用檸檬酸鹽，這也與多種芽孢桿菌都可以利用檸檬酸鈉的特徵符合。只有地衣芽孢桿菌可以利用丙酸鹽，2＃、5＃、8＃、10＃、13＃、14＃、16＃、17＃、18＃、19＃、21＃、22＃這12株均可以利用丙酸鹽，可以初步認為這12株為地衣芽孢桿菌，還需要其他的生理生化實驗來驗證。
3.2澱粉酶實驗結果
實驗的23個菌株中，11＃菌株不能水解澱粉，未產生透明圈。3＃、7＃、9＃三個菌株產生的透明圈最大，幾乎鋪滿整個平板，其餘各個菌株產生的透明圈大小不一。各個菌株水解澱粉的能力各不相同，3＃、7＃、9＃三個菌株水解澱粉的能力最強，在初步篩選出的12株地衣芽孢桿菌中，5＃菌株產澱粉酶能力較強，21＃產澱粉酶能力較差。透明圈如圖1,2,3,4,5,6。
這"槍"能打鋼珠 85塊錢廣告90後女子連捅丈夫23刀致死, 因丈夫性生活要求十分變態。頭條爆料2017-02-21男子因性器官尺寸過大被拒絕服務後, 居然對老闆做出這種事!情感頭條2017-02-18推薦閱讀：
