基於質譜的磷酸化肽段檢測

註：本文轉載自公眾號iProteome，原文作者為石文昊

基於質譜的磷酸化肽段檢測?

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從上世紀80年代開始，質譜應用於蛋白質磷酸化的檢測中，極大的推動了磷酸化蛋白質組的發展。因為質譜擁有高靈敏度、高通量的特點，並且具有位點解析度，因此基於質譜的磷酸化蛋白質組檢測方法得到不斷的發展和推廣。

磷酸化蛋白質組數據的可重複性和可信度依賴於質譜儀的掃描速度和靈敏度，近年來幾乎所有的磷酸化蛋白質組檢測都是採用串聯質譜（MS/MS），其中包括qTOF, LIT-Orbitrap，quadrupole-Orbitrap和FTICR質譜。其中近年來應用較多的的Orbitrap Fusion，掃描頻率達22Hz，快速的掃描能夠增加檢測深度和檢測通量。Gygi et al，2014，利用Orbitrap Fusion和多同位素標記策略，在10種樣品中鑒定到11000個磷酸化位點。所需機時也大幅減少，從一周縮短為兩天。而Q-Exactive HF，能夠通過分段四級桿精確選擇母離子。Olsen研究組報道，利用RPLC和Q-Exactive HF能夠從Hela中鑒定到7600個unique磷酸化肽段。同時發現，提高子離子的譜圖質量，對鑒定深度有所幫助，不過這需要犧牲一定的掃描速度。

MS數據獲取方法

蛋白質組通常採用的數據獲取方式是數據依賴型獲取方案（Data-dependent acquisition，DDA），該方法能夠自動選擇母離子並進行碎裂檢測。通常該方法選擇丰度較高的母離子，忽略了丰度較低的磷酸化肽段。近年來逐漸發展的數據非依賴獲取方案（Data-independent acquisition，DIA），將檢測範圍設置成不同的m/z範圍（比如SWATH），理論上能夠檢測所有的離子。對DDA和DIA的方法比較，發現靶向DIA方法能夠提高檢測的靈敏度5-10倍。不過該方法造成數據量增加，複雜度提高，解譜更加困難。結合DDA、DIA和靶向檢測方法，能夠結合各方法的優勢，如2012年Narumi 等在乳腺癌樣本中利用DDA進行了全蛋白檢測，同時利用靶向DIA鑒定生物標誌物。 基本定量方法

磷酸化蛋白質組的定量，與普通蛋白質組定量不同的是，同一個蛋白不同位點，可能具有不同的磷酸化水平，因此定量是需要直接檢測磷酸化肽段，基於位點的定量。對於肽段的定量方法也有很多種，基本可以分為有標定量和無標定量。

有標定量是已經活躍了近20年的定量方法，包括氨基酸細胞培養基穩定同位素標記的SILAC方法，氨基修飾標籤的mTRAQ方法，以及二甲基標記方法。這些方法可以滿足多個樣品不同標記，因此樣品可以混合成單針進行檢測。這些都是一級定量所使用的標記方法，與此同時，也有很多成熟的二級定量方法，如TMT和iTRAQ，能夠同時定量6-10個樣品。不過這種定量方式覆蓋深度會受到影響。有標定量的一個突出的限制是信號壓縮效應，分配到一起的母離子，原本的比值差異可能會被壓縮到不顯著。近年來也不斷湧現了很多新的標記方法，比如Xue等在2014年先將肽段全部去掉磷酸化，然後體外用18O-ATP作為原料，在特定激酶作用下肽段發生磷酸化修飾，修飾位點具有18O修飾。該方法可以研究激酶直接的作用底物。無標定量沒有同位素標記，是一種相對定量方法，該方法以其費用低，靈活性強，易於實驗設計等優點受到歡迎。雖然該方法不能將樣品混合，消耗檢測機時會更多，但前期樣品準備簡單，易於進行預分離，仍成為使用最廣泛的方法。無標定量的挑戰還是在數據獲取後的分析中，像Skyline和MaxQuant發展出比較成熟的磷酸化定量方法，並且MaxQuant提出match between runs的思路嘗試解決磷酸化檢測中常出現的空值問題，雖然這一方法有可能引入更多的不確定性。